Estrazione e purificazione di γ-orizanolo dalla pula di riso Liceo di Lugano 2 Lavoro di maturità in chimica 2007 Estrazione e purificazione di γ-orizanolo dalla pula di riso Brice Donati Mattia Gianinazzi Docente responsabile: Carlo DeVittori

Indice Introduzione Presentazione del problema Obiettivi del lavoro Parte sperimentale Conclusioni Bibliografia Ringraziamenti

La materia prima: la pula di riso Scarto della raffinazione del riso Miscuglio composto da “pellicola argentea” e gemma Ricca in lipidi, vitamine e minerali Si può ricavarne un olio Contiene γ-orizanolo Attualmente poco sfruttata per alimentazione umana nella produzione di olio di pula (paesi asiatici), poco redditizia In mancanza di richiesta per la zootecnia da noi rappresenta un problema di smaltimento

Il γ-orizanolo Miscuglio di acidi ferulici esterificati con alcoli triterpeni e steroli vegetali ( 10 composti); Presente nell’olio di pula di riso in concentrazioni 0.6 - 2.9%; Proprietà terapeutiche contro alcune malattie (ipercolesterolemia, iperlipidemia, neurosi vegetativa, ecc.); Proprietà antiossidanti; Di interesse anche in campo cosmetico e come integratore alimentare.

Presentazione del problema La pula di riso è uno scarto di lavorazione economicamente poco interessante ma valorizzabile attraverso l’estrazione di principi attivi contenuti quali il γ-orizanolo; Non sono descritti in letteratura procedimenti di estrazione su scala industriale Non sono descritti in letteratura metodi di estrazione e di purificazione preparative di γ-orizanolo senza l’utilizzo di solventi organici; Le caratteristiche chimico-fisiche dei componenti del γ-orizanolo rendono difficile l’estrazione e la separazione di γ-orizanolo dall’olio; Irreperibilità di uno standard di γ-orizanolo; Sintesi chimica di γ-orizanolo difficilmente realizzabile.

Obiettivi del lavoro Verificare qualitativamente e quantitativamente la presenza di γ- orizanolo nella pula di riso; Sviluppare un processo di estrazione del γ-orizanolo dalla pula di riso che ne assicuri la naturalezza e che sia applicabile su scala industriale; Ottimizzare il metodo mediante uno studio parametrico del processo; Sviluppare un metodo di purificazione o di concentrazione del γ- orizanolo dagli estratti ottenuti

Pianificazione degli esperimenti Verifica del metodo analitico per la quantificazione del γ-orizanolo negli estratti; Verifica del contenuto di γ-orizanolo nella materia prima a nostra disposizione (pula di riso della Riseria di Taverne); Prove di estrazione con fluido supercritico e verifica dell’efficienza per il γ-orizanolo (concentrazione nell’estratto e resa totale); Sperimentazione di metodi di frazionamento dell’estratto o di estrazione frazionata allo scopo di ottenere frazioni altamente concentrate in γ-orizanolo; Sperimentazione di metodi per purificare il γ-orizanolo dall’estratto o dalle frazioni più concentrate dell’estratto.

Estrazione dolce (« Green chemistry ») Fluido supercritico quale solvente Dall’equilibrio liquido-vapore si passa ad una fase aeriforme ad alta densità con un composto atossico e non infiammabile (CO2)

Estrazione con fluido supercritico Solvente: CO2 puro Pressione (autoclave): 280 bar Temperatura (autoclave): 40°C Portata del solvente: 1.5 kg/h Massa caricata: 100 g Tempo di estrazione: 3 h Carico di pula: 104 g Le condizioni sono state fissate sulla base dei lavori specifici pubblicati sull’estrazione dell’olio dalla pula e sui lavori pubblicati sull’estrazione in generali di oli da semi e da farine.

Estrazione con fluido supercritico L’estratto ottenuto si presenta come una massa pastosa-oleosa di colore giallo-verde chiaro che fonde a 50°C. I costituenti principali dell’estratto sono cere e trigliceridi. La separazione delle cere permette di ottenere il classico olio di pula Resa dell’estrazione: 16 g di estratto pari al 15.4% della pula caricata Resa massima durante i primi 100 minuti

Estrazione Soxhlet Metodo di estrazione con impiego di un solvente organico. Carico: 22.40 g di pula di riso Solvente: esano Tempo di estrazione: 3 h (20 cicli) Risultati: L’estratto si presenta come una pasta semi-solida di colore giallo-scuro. Resa: 19% Punto di fusione: 50-51%

Analisi dell’estratto mediante spettofotometria UV Scopo: quantitifcazione del -orizanolo nell’estratto Strumenti: • Spettrofotometro Kontron UVIKON 930 • Bilancia analitica Mettler A50 Reagenti: • n-eptano per spettrofotometria UV puro per analisi Carlo Erba Procedimento: • In un matraccio graduato da 50 mL pesare esattamente circa 0.1 g di campione e portare a volume con il solvente prescritto. • La soluzione risultante deve essere perfettamente limpida. • Leggere allo spettrofotometro il valore d’estinzione alla lunghezza d’onda di 315 nm, usando come solventeoluzione di riferimento il solvente impiegato. • I valori d’estinzione devono essere compresi tra 0.1 e 0.8; in caso contrario, ripetere le misurazioni operando con soluzioni più concentrate o più diluite. Espressione risultati: Dove: • A è il valore di estinzione assorbanza • W è la concentrazione della soluzione in g di olio/100mL di soluzione • 359 è il coefficiente di estinzione del γ-orizanolo

Confronto dei metodi di estrazione SC-CO2 Soxhlet Resa (%) 16 19 Orizanolo (%) 3.30 4.39 Conclusioni: l’estrazione con SCCO2 permette di ottenere il 63% del -orizanolo estraibile con il metodo soxhlet; il risultato è buono ma il processo va ottimizzato con una ricerca sui parametri p, T, tempo e portata.

Sintesi chimica del ß-sitosteril ferulato Scopo: disporre di uno standard di riferimento per analisi cromatografiche degli estratti Metodo: esterificazione di ß-sitosterolo e acido ferulico Reagenti: ß-sitosterolo: 3 mmol (in eccesso, 1.24 g) Acido ferulico: 1 mmol (0.194 g) n-eptano (solvente), acido solforico (catalizzatore) Risultati: Formazione di un miscuglio eterogeneo solido-liquido di colore scuro e molto viscoso.

Caratterizzazione dell’estere: spettroscopia IR Dallo spettro IR si nota che non vi sono bande di assorbimento del legame C=O tipico degli esteri. Conclusioni: la sintesi non riesce. La causa è probabilmente un’eccessiva reattività dell’acido solforico; l’esperimento andrebbe rifatto utilizzando un acido blando quale l’acido p-toluensolfonico. Si rinuncia per il momento alla cromatografia quale tecnica per l’analisi degli estratti dispondendo della tecnica UV.

Concentrazione del -orizanolo tramite estrazione in fase solida (SPE) Il miscuglio viene caricato su una colonna di fase stazionaria adsorbente con polarità adeguata. Mediante solventi di polarità inversa vengono trasportati attraverso la colonna i composti solubili nella fase mobile mentre rimangono trattenuti i composti non solubili o molto interattivi con la fase stazionaria (adsorbiti). Con un eluente adatto vengono in seguito desorbiti (eluiti) i composti precedentmente trattenuti. Si possono quindi sfruttare le differenti polarità tra γ-orizanolo, cere e trigliceridi Fase solida: ossido di alluminio (polare) Fase mobile: eptano (apolare) Miscuglio: olio di riso contenente 1% -orizanolo

Concentrazione del -orizanolo tramite estrazione in fase solida (SPE) Si sfruttano le differenti polarità tra γ-orizanolo (relativamente polare), cere e trigliceridi (apolari) Fase solida: ossido di alluminio (polare) Lavaggio con eptano (solvente apolare) per il trasporto delle cere e dei trigliceridi; il γ-orizanolo viene trattenuto dalla fase stazionaria. Eluizione del γ-orizanolo mediante etanolo (solvente polare) Diluizione Olio Scotti : n-eptano Valore d’assorbanza Concentrazione di γ-orizanolo (%) 9 :1 Estratto: 0.1012 I° eluato: 0.5641 0.28 3.14 5 : 5 Estratto: 0.1022 I° eluato: 0.6731 0.56 3.75 1 : 9 Estratto: 0.2598 I°eluato: 0.7475 1.45 4.16

Concentrazione del -orizanolo tramite estrazione in fase solida (SPE) Confronto dell’effetto di concentrazione utilizzando altre fasi stazionarie Fase solida: Silicagel (apolare) Lavaggio con eptano (solvente apolare) per il trasporto delle cere e dei trigliceridi; il γ-orizanolo viene trattenuto dalla fase stazionaria. Eluizione del γ-orizanolo mediante etanolo (solvente polare) Diluizione Olio Scotti : n-eptano Valore d’assorbanza Concentrazione di γ-orizanolo (%) 9 :1 5 : 5 1 : 9

Concentrazione mediante SPE: conclusioni La tecnica SPE potrebbe ora essere applicato all’estratto grezzo ottenuto da estrazione con CO2 densa, utilizzando una fase stazionaria molto polare, un solvente di lavaggio apolare e un solvente di eluizione relativamente polare. Il solvente di lavaggio eptano, essendo apolare, potrebbe essere sostituito da CO2 densa L’applicazione del metodo all’estratto grezzo risulta problematica a causa della sua pastosità e viscosità. Sarebbe quindi utile ottenere frazioni di estratto già preconcentrate così da ridurre le masse di carico.

Concentrazione di γ-orizanolo mediante frazionamento dell’estratto L’estrazione è condotta in modo da raccogliere nel tempo singole frazioni di estratto da analizzare per il contenuto di γ-orizanolo. L’estrazione viene condotta dapprima in condizioni adatte all’estrazione delle cere (p = 80-100 bar, T = 50°C). Dopo esaurimento delle cere la densità della CO2 viene drasticamente aumentata (p = 300 bar, T = 40°C). Frazione Massa CO2 (kg) [γ-orizanolo] (%) 1 4.8 1.14 4 30.7 0.86 7 51.9 1.05 10 74.7 1.48 13 191.0 3.26 14 197.7 7.76 16 214.0 6.26 17 216.8 4.25

Concentrazione di γ-orizanolo mediante frazionamento dell’estratto Frazione Massa CO2 (kg) massa estratto (g) massa γ-orizanolo (mg) 1 4.8 1.30 14.88 4 30.7 2.11 18.22 7 51.9 2.58 27.11 10 74.7 1.31 19.39 13 191.0 1.08 35.21 14 197.7 0.58 45.02 16 214.0 0.28 17.53 17 216.8 0.10 4.25

Concentrazione mediante frazionamento: conclusioni Attraverso l’estrazione frazionata si ottengono campioni concentrati fino al 7% in -orizanolo. Le frazioni 14 e 16 riunite rappresentano il 10% dell’estratto totale e contengono quasi il 50% del -orizanolo estratto. Parecchio -orizanolo viene coestratto con le cere: occorre migliorare questa fase di estrazione riducendo la capacità estrattiva della CO2 per il -orizanolo nella prima fase del processo, giocando ulteriormente sui parametri p e T. L’applicazione della tecnica SPE con Alox/Eptano/Etanolo alle frazioni concentrate dovrebbe permettere di raggiungere concentrazioni di γ- orizanolo superiori al 20%.

Conclusioni finali Pensiamo che sia quindi realizzabile una procedura consistente nelle seguenti fasi: 1. Estrazione della pula con CO2 densa a circa 100 bar (possibilmente solo 80-90) e 50°C fino a esaurimento delle cere (cessazione di accumulo di estratto); 2. Continuazione dell’estrazione con CO2 densa a 300 bar e 40°C con produzione di un estratto oleoso ricco di orizanolo (circa 7%); 3. Passaggio forzato dell’estratto concentrato in orizanolo su fase solida di ALOX mediante CO2 densa quale solvente (eluizione dei trigliceridi e trattenuta dell’orizanolo); 4. Eluizione della fase solida ALOX con etanolo e raccolta di un concentrato in orizanolo; 5. Distillazione dell’etanolo.

Ringraziamenti Ringraziamo: Il Prof. Carlo DeVittori per il lavoro di assistenza; La Riseria di Taverne SA e in particolare la Signora Ing. Paola Galli per le spiegazioni dateci sulla lavorazione del riso e per la fornitura di pula di riso; Il reparto controllo qualità dell’Oleificio SABO di Manno per le informazioni sulla produzione di olio di riso e per il controllo d’analisi del γ-orizanolo.