STUDIO DELLA STRUTTURA E DELLA SIMMETRIA DI UN ENZIMA TRAMITE MUTAGENESI La tirosil-tRNA sintetasi ha delle interessanti proprietà connesse alla sua simmetria: Sebbene l’omodimero sia simmetrico nel cristallo, esso in soluzione lega solo una mole di tirosina e forma una sola mole di tirosil adenilato. Questo fenomeno, che va sotto il nome di “half of the sites reactivity” è stato studiato tramite ingegneria proteica per sapere se l’asimmetria funzionale fosse indotta dal legame con i substrati o se fosse preesistente.
DELEZIONE DEL DOMINIO C-TERMINALE
COSTRUZIONE DEGLI ETERODIMERI
SEPARAZIONE DEGLI ETERODIMERI
Una seconda mutazione H45N può essere introdotta in una delle due subunità degli eterodimeri per ridurre drasticamente la velocità di attivazione della tirosina in quella subunità. I risultati mostrano che sebbene il tRNA si leghi alla subunità di dimensioni normali, la sua acilazione avviene nell’altra subunità
L’asimmetria è preesistente nell’enzima in soluzione 0,5 moles of Tyr-AMP are formed at wild-type rate 0,5 moles at mutant rate = subunità attiva = subunità inattiva Se l’asimmetria fosse indotta dalla formazione del Tyr-AMP, allora questo si formerebbe e sarebbe presente solo nelle subunità selvatiche, al contrario di quanto si osserva. Inoltre si formerebbe solo una mole alla velocità del selvatico (wild type rate).
Subtilisina