Spettroscopia NMR  Permette di distinguere i diversi nuclei atomici sulla base delle loro proprietà magnetiche mediate dall’intorno chimico.  Permette.

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2 Spettroscopia NMR  Permette di distinguere i diversi nuclei atomici sulla base delle loro proprietà magnetiche mediate dall’intorno chimico.  Permette di misurare distanze inter-protoniche.  Permette di misurare gli angoli diedri dei legami covalenti.

3 Spettroscopia NMR interazione tra la componente magnetica del
campo elettromagnetico associato ad una radiazione incidente sul campione ed i nuclei magnetici (1H, 13C, 15N, 31P) contenuti nel campione immerso in un campo magnetico esterno

4 Tutti i nuclei hanno una massa e una carica
Tutti i nuclei hanno una massa e una carica. Quelli che hanno il numero di massa oppure il numero atomico, o entrambi dispari, posseggono un momento angolare ossia uno “spin”. La risonanza magnetica è un fenomeno completamente differente dalla “teoria della risonanza”. Qualunque nucleo che possegga uno spin può essere studiato con l’NMR. Il nucleo dell’idrogeno 1H è quello che fornisce il maggior numero di informazioni, mentre l’isotopo più comune del del carbonio 12C non compare nello spettro NMR perché non ha uno spin nucleare.

5 Lo spin nucleare Lo spin è una proprietà fondamentale come la carica e la massa. Protoni, elettroni e neutroni possiedono uno spin. Molti nuclei atomici si comportano come delle particelle cariche che ruotano intorno al proprio asse. Il momento angolare o momento di spin P che ne risulta è ovviamente quantizzato. P = P è un vettore orientato lungo l’asse della rotazione, e il numero di spin I è un indice dell’intensità (o modulo) di questo momento angolare. I= numero di spin valori=0, ½, 1, e così via fino a 6.

6 Effetto di un campo magnetico esterno (per I=1/2)
Nello stato fondamentale tutti gli spin nucleari sono disordinati e non ci sono differenze di energia. Applicando un forte campo magnetico esterno, gli spin si allineano con esso. In questo stato c’è sempre un piccolo eccesso di nuclei allineati nella direzione del campo applicato.

7  Spin-spin coupling Livelli energetici Beff = B0 + Blocale
Il campo magnetico esterno (B0) crea una differenza di energia tra i nuclei allineati nelle due direzioni: DE = hn0 (risonanza di spin). L’intorno chimico influenza il campo magnetico effettivo presente su ogni nucleo, e quindi anche la DE = hn0: Beff = B0 + Blocale  Chemical shift  Spin-spin coupling Gli spin nucleari, inoltre, interagiscono magneticamente l’uno con l’altro:

8 Numeri di spin di alcuni nuclei
Elemento 1H 2H 12C 13C 14N 16O 17O 19F Numero quantico di spin ( I ) 1/ / /2 1/2 Orientazioni Elementi con numero di massa o numero atomico dispari sono dotati di “spin nucleare”. Gli isotopi più abbondanti del C e dell’ O non possiedono spin.

9 Momento magnetico nucleare
Poiché il nucleo atomico è carico, e ogni carica in movimento genera un campo magnetico, ogni nucleo dotato di spin si comporterà come un piccolo magnete, cioè sarà dotato di un momento magnetico m. Il momento magnetico m è proporzionale al momento di spin e ne ha la stessa direzione: quindi il suo modulo non può variare, e può assumere solo due possibili orientazioni per un nucleo con I = ½. La costante di proporzionalità tra il momento magnetico m ed il momento angolare nucleare P è detta costante giromagnetica m m = g P + m g= rapporto giromagnetico mz = g Pz = m g

10 Come funziona uno spettrometro NMR?
Quando un composto contenente idrogeno è introdotto in un forte campo magnetico ed è irradiato con una radiazione elettromagnetica, i nuclei di idrogeno assorbono energia. Naturalmente, come tutti i fenomeni che avvengono su scala atomica, anche questo assorbimento è quantizzato e si verifica solo quando la forza del campo magnetico e la frequenza della radiazione non raggiungono determinati valori. Gli spettrometri NMR sono in grado di misurare tale assorbimento. Uno spettrometro è costituito da un magnete molto potente ed è in grado di generare un campo di radiofrequenze mediante il passaggio di corrente elettrica in una bobina avvolta intorno al campione.

11 Lo spettrometro Uno spettrometro NMR è formato da alcuni componenti fondamentali: un magnete, che deve produrre un intenso ed uniforme campo magnetico nel quale deve essere posto il campione un generatore di radiofrequenza un ricevitore di radiofrequenza.

12 Magnet giving the currently highest field (18T, 800MHz, 1H resonance frequency)
Courtesy of Oxford Instruments Ltd.

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14 Per ottenere lo spettro NMR si colloca il campione all’interno dello strumento e lo si irradia con energia elettromagnetica di frequenza costante: la grandezza che varia è l’intensità del campo magnetico. Quando il campo magnetico raggiunge l’intensità appropriata, i nuclei entrano in risonanza (cioè assorbono energia). Questo fenomeno genera una debole corrente elettrica che viene amplificata e trasformata in un segnale su di un foglio di carta calibrata. Uno spettro NMR è dato dalla registrazione del voltaggio indotto in funzione della variazione del campo magnetico. L’area sotto il picco dipende dal numero totale di nuclei che hanno compiuto il salto.

15 NMR ad onda continua Per ottenere lo spettro NMR si può:
variare con continuità la frequenza della radiazione elettromagnetica e misurare l’assorbimento per ogni frequenza (scansione della frequenza) lasciare costante la frequenza della radiazione elettromagnetica e variare con continuità il campo magnetico (scansione del campo): all’aumentare del campo magnetico entreranno in risonanza protoni via via più schermati, e si otterrà comunque uno spettro.

16 NMR a impulsi (n1 ..... nn) n2 n1 n3 N S RF a banda larga
Contiene un intervallo di frequenze RF a banda larga Con un singolo impulso sono eccitati simultaneamente tutti i protoni N S n1 n2 n3 (n nn)

17 Schema generale di un esperimento NMR
Il campione è posto in un campo magnetico B L’invio di un impulso elettromagnetico perturba l’equilibrio La precessione della magnetizzazione genera un segnale elettrico noto come FID (Free Induction Decay) Il FID è registrato, e quindi trasformato di Fourier, nel dominio della frequenza: FID(t) →  ()

18 FREE INDUCTION DECAY ( rilassamento )
Ogni nucleo emette una radiazione alla propria frequenza di risonanza, per cui quello che si ottiene è una sovrapposizione di onde sinusoidali a diverse frequenze.

19 FID totale spettro nel “dominio de tempo” n1 + n2 + n tempo

20 TRASFORMATA DI FOURIER
Il complesso segnale del FID è trasformato nello spettro NMR attraverso complesse operazioni matematiche DOMINIO DEL TEMPO Convertito in DOMINIO DELLE FREQUENZE FID SPETTRO NMR FT-NMR SEGNALE COMPLESSO n1 + n2 + n Frequenze individuali Un insieme di frequenze che decadono nel tempo Spettro NMR

21 Il FID è trasformato in un classico spettro NMR
spettro nel “dominio delle fequenze”

22 Il chemical shift B= B0 (1-s)
Sotto l’influenza del campo magnetico esterno gli elettroni tendono ad assumere un movimento rotatorio, e ruotando generano essi stessi un campo magnetico. Nonostante tutti i nuclei di una certo tipo (per esempio 1H) siano esattamente identici, essi risuonano a frequenze leggermente diverse purchè si trovino in intorni chimici differenti. Il campo magnetico generato si oppone al campo magnetico esterno nella zona centrale dell’orbitale, mentre si somma nella sua periferia. Poiché il nucleo si trova al centro dell’atomo, esso sarà sottoposto ad un campo magnetico effettivo minore di quello applicato, è cioè schermato dagli elettroni. B= B0 (1-s)

23 Misura del chemical shift
Dipende dal campo Indipendente dalle condizioni sperimentali Perché il TMS? dodici protoni equivalenti e molto schermati solubile nella maggior parte dei solventi organici facilmente allontanabile

24 Il chemical shift protonico
d- d+ C H Cl Elemento elettronegativo Il principale fattore che dermina il chemical shift di un protone è la densità elettronica del relativo idrogeno. Composto CH3X CH3F CH3OH CH3Cl CH3Br CH3I CH4 (CH3)4Si Elemento X F O Cl Br I H Si Elettronegatività of X Chemical shift d TMS Più deschermati Il potere deschermante aumenta con l’elettronegatività di X

25 d (ppm) -OH -NH Campi alti Idrogeni schermati Campi bassi
Idrogeni deschermati CHCl3 , TMS d (ppm) 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 H CH2F CH2Cl CH2Br CH2I CH2O CH2NO2 CH2Ar CH2NR2 CH2S C C-H C=C-CH2 CH2-C- C-CH-C RCOOH RCHO C=C C C-CH2-C C-CH3 O

26 CHEMICAL SHIFTS (ppm) R-CH3 0.7 - 1.3 R-C=C-C-H 1.6 - 2.6
R-C-C-H O RO-C-C-H HO-C-C-H N C-C-H R-C C-C-H C-H R-N-C-H R-S-C-H I-C-H Br-C-H Cl-C-H RO-C-H HO-C-H R-C-O-C-H R-C=C-H H R-C-H R-C-O-H O2N-C-H F-C-H R3CH R-CH2-R R-N-H Ar-N-H R-S-H R-O-H Ar-O-H R-C-N-H R-C C-H

27 Integrazione L’intensità di un segnale nello spettro NMR è proporzionale al numero di protoni che lo genera.

28 Acetato di benzile 55 : 22 : 33 = 5 : 2 : 3 Linea integrale
L’altezza delle linee integrali è proporzionale al numero di H di ciascun picco 55 : 22 : = : 2 : 3 Linea integrale

29 1,1,2-tricloroetano integrale = 2 integrale = 1 tripletto doppietto

30 La frequenza di risonanza di HA dipende dagli stati di spin dei nuclei vicini
Allineato con B0 Opposto a Bo +1/2 -1/2 50 % di molecole 50 % di molecole H H H H A A C C C C Bo doppietto

31 La costante di accoppiamento
La distanza (= differenza di frequenza) tra i due segnali del doppietto (di solito detti rami del doppietto) è detta costante di accopiamento ed indicata col simbolo J. Il chemical shift del protone che dà origine al doppietto è misurato al centro del doppietto.

32 L’ accoppiamento spin-spin è dovuto alle interazioni tra i momenti magnetici nucleari, che sono indipendenti dal campo magnetico applicato B0 per cui le costanti di accoppiamento J sono indipendenti dal campo magnetico applicato e risultano uguali in qualunque spettrometro. Si misurano in Hz e non in ppm. 60 MHz L’ aspetto dello spettro varia al variare del campo dello spettrometro 200 MHz 600 MHz

33 La regola n+1 singletti doppietti tripletti quartetti quintetti
Per prevedere la molteplicità singletti doppietti tripletti quartetti quintetti sestetti septetti Due nuclei vicini n+1 = 3 tripletto Un nucleo vicino n+1 = 2 doppietto

34 ( x = y ) ( x = y )

35 Il triangolo di Tartaglia
Intensità delle linee del multipletto 1 singletto 1 1 doppietto tripletto quartetto quintetto sestetto eptetto ottetto

36 Spettro NMR del Bromoetano

37 Spettro NMR dell'acetaldeide

38 Spettro NMR del 2-nitropropano

39 Eccezioni alla regola N+1
Protoni equivalenti per simmetria non accoppiano Nessun accoppiamento se x=y 1) 2) accoppiamenti tra protoni con chemical shift coincidenti non sono visibili or IMPORTANTE !

40 Costanti di accoppiamento
Costante di accoppiamento geminale 2J 2J Protoni su carboni sp3: J  Hz Protoni su carboni sp2: J  1-3 Hz 3J Costante di accoppiamento vicinale 3J.

41 3J Costante di accoppiamento vicinale 3J.
Legame singolo, libera rotazione: J  7 Hz Legame singolo, rotazione impedita: legge di Karplus Legame singolo, cicli a 6 termini (forma a sedia): Jax,ax  10 Hz Jax,eq  3 Hz Jeq,eq  3 Hz Legame singolo, cicli a 5 termini: J  5 Hz (cis,trans) Legame doppio: Jcis  7-11 Hz Jtrans  Hz Composti aromatici a 6 termini: Jorto  7-9 Hz Composti aromatici a 5 termini: Jorto  3-5 Hz

42 Costante di accoppiamento long-range.
Accoppiamento allilico (4J: CH-C=CH): J  0-2 Hz Accoppiamento omoallilico (5J: CH-C=C-CH): J  0-2 Hz Accoppiamenti meta e para in composti aromatici: Jmeta  1-3 Hz Jpara  0-1 Hz Accoppiamento W: 4J  0-7 Hz

43 Protoni equivalenti Molto spesso i protoni possono risuonare alla stessa frequenza perché si trovano nello stesso intorno chimico, ossia perché sono equivalenti: per simmetria per rotazione libera

44 NMR monodimensionale FID = Free Induction Decay
La FT-NMR monodimensionale rivela i chemical shift di tutti i nuclei presenti nel campione

45 Simple chemicals can be identified by their NMR spectra
It is worth looking at how simple chemicals can be identified from NMR spectra, as this is the basis for the determination of the structure of a protein. As mentioned, the resonance frequency of a proton varies according to it's environment. At a basic level, the most important factor that effects the chemical shift of a proton is it's local shielding by electrons. As you know, hydrogens in a chemical may have partial positive or negative charge due to the chemical group they are attached to; for example, the hydrogens in an NH3+ group are slightly positively charged because nitrogen withdraws the electrons from the hydrogens. When a magnetic field is applied to an atom, the strength of the field that the nucleus sees is determined mostly by it's electrons, which shield the nucleus from the full effect. If the hydrogen is slightly negatively charged, then there are effectively more electrons present and the amount of shielding is greater than for an uncharged or slightly positively charged hydrogen. The more shielded a proton is, the less of the external magnetic field it experiences, which means the separation between energy levels is less for a partially negatively charged proton than for others, and the resonance frequency is lower. This is the reason that an amide hydrogen has a chemical shift of about 10ppm while a methyl (CH3) proton has a chemical shift of about 2ppm, which corresponds to a lower frequency. The resonance frequency of a hydrogen is also affected by the spin states of protons which are at most three covalent bonds away  (ie. by coupled protons). The spinning of a proton affects the distribution of it's electrons, and this change is communicated through covalent bonds to nearby protons, which affects the resonance frequencies of those protons provided they are not chemically equivalent to the first. If there is a group of three chemically equivalent protons coupled to one (not chemically equivalent) proton, then the group of three protons will have a different resonance frequency depending on whether the nuclear spin of the individual proton is aligned with or against the magnetic field. There are many molecules in a sample, and the individual protons will be distributed approximately equally across the two energy levels, so the group of three protons is seen as two equally intense peaks.  The signal of the individual proton will also be split, because it is affected by the spin states of the three protons it is coupled to. There are eight ways the spins of these three protons can be aligned (U=up D=down): UUU, UUD, UDU, DUU, DDU, DUD, UDD, DDD. We do not see eight peaks because when there are three chemically equivalent protons, it is irrelevant which one is spinning up and which one down, so UUD, UDU and DUU are all equivalent. Because there are three ways to have 2 up 1 down, that peak has three times the intensity of the peak for UUU, which can only happen one way. So for the individual proton we see a multiplet with four peaks (a quartet) with the intensity ratios 1:3:3:1. In general, the absorption peak of a group of protons is split into n+1 lines, where n is the number of equivalent coupled spins. The intensities of peaks follows Pascal's triangle (1, 1 1, 1 2 1, , etc.) These split peaks are called the fine structure of a spectrum. To determine the structure of a protein using NMR, it is necessary to use more complex methods than basic NMR as described. The above is a spectrum of ethanol (CH3CH2OH). The CH2 is coupled to the CH3 and is split into a quartet. The CH3 is coupled to the CH2 and is split into a triplet. Hydroxyl protons rapidly exchange with protons in solution and are not split. The above is a spectrum of ethanol (CH3CH2OH). The CH2 is coupled to the CH3 and is split into a quartet. The CH3 is coupled to the CH2 and is split into a triplet. Hydroxyl protons rapidly exchange with protons in solution and are not split.

46 Altri esempi di spettri NMR-1H monodimensionali
Cellulasi (36 residui) Etanolo

47 Advantages Can be performed in aqueous solutions under in vivo conditions Does not rely on specific reporter groups or artificially attached dyes Don’t need to crystallize the protein Large array of parameters can be extracted from the resonance lines -         all NMR measurements can be performed in aqueous solutions under conditions that are close to the physiological conditions in which the protein exists (in vivo) -         does not rely on specific reporter groups (ie. aromatic side chains on residues) or artificially attached dyes o       essentially every single atom can be observable via its resonance line in the spectrum as a result – the entire protein can be monitored in a direct manner without substantial intervening calculations -         don’t need to crystallize the proteins o       many proteins can’t be crystallized many detailed features of protein structure in the crystal state can be distorted by crystal packing interactions and the presence of high concentrations of cosolvents needed to induce crystallization o         o       -         large array of parameters can be extracted from resonance lines o       ID and characterization of ligand interactions o       Mapping of ligand-binding surfaces o       Elucidation of polypeptide folding pathways o       Determination of the 3D molecular solution structure and a description of the 3-D molecular solution structure o       Description of its dynamic properties on time-scales o       exploited to get the 3-D structure of proteins and the nature of their interactions with other molecules, as well as biological function and dynamic properties.

48 Problems Overcrowded spectra Limited space available in spectrum
Typical width of resonance line is larger for a protein than a polypeptide so the peak height is decreased (decreases sensitivity) Limited to small proteins (less than 150 residues) -         over crowded spectra o       every single atom in a protein has the potential to generate an NMR signal (ie. a 100 aa can yield about 1000 proton NMR lines) -         limited space available in the spectrum o       limits peak resolution so the spectral bandwidth available for the signals is limited and there is overlap -         typical width of resonance line is larger for protein than the peptide thus the peak height is decreased o       more overlap o       decreases sensitivity (S/N ratio: ratio of signal height to the level of noise generated from the experiment)

49 Magnetic interactions between Nuclei –Basis of Protein NMR
Covalent bonds result in cross-talk between spins (scalar coupling) Can extent over four or five bonds An excited state of a single set of nuclei is produced and transferred to another nucleus The rate of the energy exchange is related to the distance between the two atoms §         Strength is denoted as J, or the scalar coupling constant ·        Build-up of a spin-spin correlation takes place over a time period that is inversely proportional to the magnitude of the scalar coupling constant  during this process the signal can get diverted (relaxation)

50 H1 NMR spectrum of lysozyme
The NMR spectrum of lysozyme at pH 4.0, 58ºC H1 NMR spectrum of lysozyme Proteins have many hydrogens and therefore many peaks. The peaks seen are very sharp because nucleii tend to stay in their excited state for a relatively long time, (it is a spectroscopic principle that the linewidth of an absorption line is inversely proportional to the lifetime of the excited state) but with proteins there can easily be so many peaks in some regions of the spectrum that they cannot be resolved. Remember that, on average, each amino acid has eight hydrogens. Technological development in superconducting magnets result in progressively increased magnetic field strength, with accompanying increases in inherent spatial resolution and sensitivity. As you can see from the spectrum of lysozyme (a relatively small protein at only 14.6kDa) the NMR spectrum of a protein is very complex and contains many signals, some of which will overlap, because many protons are in very similar environments. In order to solve the structure of a protein, more complex NMR methods are needed. In effect, these methods allow (i) the NMR spectrum to be assigned (i.e. every signal in the spectrum identified in terms of the proton in the protein) and (ii) a family of distance constraints between pairs of spatially proximal protons in the structure to be collected, from which a structure is calculated.

51 NMR-Bidimensionale Gli spettri protonici e 13C sono grafici a due dimensioni che riportano il c. s in funzione dell’intensità del segnale. Tuttavia li si definisce esperimenti monodimensionali in quanto esiste una sola variabile indipendente rappresentata dalla frequenza che deriva dall’ FT del FID. Nelle tecniche monodimensionali classiche la sequenza degli eventi è la seguente: Nelle tecniche bidimensionali si introduce, dopo l’impulso e prima dell’acquisizione un periodo di evoluzione variabile t1. Ciascun FID sarà quindi funzioni di due variabili di tempo t1 e t2

52 In pratica però i FID ottenuti sono sottoposti a due serie di trasformate di FT nei due domini di tempo sfasate di 90°. Avremo quindi un esperimento in due dimensioni n1 e n2

53 Tipi di esperimenti bidimensionali
Esperimenti omonucleari 2D-COSY (1H-1H scalare) HOHAHA (1H-1H scalare) NOESY (1H-1H dipolare) Esperimenti eteronucleri HMQC (1H-13C diretta, 1J) HMBC (1H-13C long-range, 2J, 3J)

54 Rappresentazione schematica di uno spettro NMR 2D di due spin A e B fra loro interagenti
w1 w2

55 2-D spectra COSY 1H NMR for a 17res protein If the peaks on the diagonal were plotted along the diagonal line, the 1D spectra would also be shown Off-diagonal peaks show when a spin-spin interaction occurs between two protons Rubinson and Rubinson. Contemporary Instrumental Analysis. Prentice Hall: New Jersey, 2000.

56 Schema della sequenza di impulsi in un esperimento 2D-NOESY (2D-Nuclear Overhauser Exchange SpectroscopY) Schema generale Schema della sequenza di impulsi in un esperimento 2D-NOESY Gli spettri COSY rivelano un accoppiamento “through-bond”. Gli spettri NOESY rivelano un secondo tipo di accoppiamento, fra dipoli nucleari, che si verifica attraverso lo spazio (“through space”).

57 Structure Assignment Intraresidual coupling Interresidual coupling
The aim of the analysis of NMR spectra is to extract all available information about interatomic distances and torsion angles. In the initial stage of investigation by NMR spectroscopy each resonance must be associated with a specific nucleus in the investigated molecule. This process is called assignment. The strategies employed for the assignment procedure depend on whether only homonuclear 2D spectra are available (unlabelled proteins), whether 15N heteronuclear spectra are available (15N labelled proteins) or whether triple resonance spectra (15N/13C doubly labelled proteins) are available. But in general the assignment can be divided in two parts: The sequential assignment of the amino acids in the protein sequence and the assignment of the amino acid side chains. As well as NH to NH or CH-alpha interactions, NOESY spectra show the interactions of any proton with any other proton that may be far away in the primary sequence of the protein, but is close in 3D space. Sequential assignment effectively assigns the NMR spectrum of a protein (determines which peak corresponds to which proton), and the additional data of the NOESY spectrum allows determination of the 3D structure by giving a large set of constraints on the possible distances between certain protons. As the diagram above shows, NOESY can jump from NH to CH-alpha, and under some circumstances, also from NH to NH. We always see a signal for the NH to CH-alpha correlation; in alpha helices, additional signals for NH to NH interactions are seen because they are close in space. The two possibilities give distinct fingerprints on a NOESY spectrum, which allows identification of elements of secondary structure. For example, in alpha helices, peptide NH groups are brought close together so we see lots of off-diagonal peaks in the NH region of the spectrum. All the data gained from COSY and NOESY experiments is fed into a computer, which calculates a set of possible structures that all satisfy the distance constraints. The results are sometimes shown with 10 or 20 of these possible structures overlayed, like the diagram below which shows the structure of the C-terminal domain of a cellulase, which was calculated from the 2D NOESY spectrum above. Interresidual coupling

58 Schema di una interazione “through-space” e del suo relativo spettro 2D-NOESY

59 Esempio reale di spettro NOESY

60 Informazioni derivanti da spettri NMR NOESY
(a) Mediante spettri NOESY possono essere identificati i residui adiacenti nella sequenza in una proteina. (b) Gli spettri NOESY identificano anche gli atomi di H di residui non adiacenti nella struttura primaria che interagiscono in regioni di struttura secondaria.

61 Struttura tridimensionale del dominio C-terminale della cellulasi derivante dallo spettro bidimensionale visto precedentemente

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63 Uso della spettroscopia NMR nello studio del folding di proteine

64 2D- NOESY Spectrum 2-dimensional NMR spectra are produced by varying the conditions of the experiment. Basically, this involves applying more than one pulse to the sample before measuring the decay. These pulses are short (a few µs) and applied in quick succession, but varying the nature of the pulses and the time between them allows magnetization to be distributed amongst protons in the sample in a way that allows spatial or coupling correlations to be identified. Both NOESY and COSY spectra are assembled from the data gained from several experiments, each using different pulse patterns. In NOESY, for example, many spectra are measured, the variation between them being the gap between the two pulses applied, which is increased incrementally to gain hundreds of spectra. This data is then assembled into a two-dimensional spectrum, by Fourier transformation in two dimensions, as shown below. The diagonal of a COSY of NOESY spectrum corresponds to the one dimensional spectrum gained by frequency scanning or pulse Fourier transform. The intensity of peaks is better shown on 3D diagrams of these spectra, which show the above diagram as a plane, with intensity peaks projecting out of that plane; you can see that the intensities on this diagram (which is essentially a contour map) can be roughly determined by the sizes of spots. The nature of the off-diagonal peaks is different for NOESY and COSY spectra.