CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO

Presentazione sul tema: "CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO"— Transcript della presentazione:

1 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE NORMALE E IN FASE INVERSA Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

2 Normal-Phase HPLC Principle: Adsorption of analytes on the polar, weakly acidic surface of silica gel. Stationary Phase.: Silica (pH 2-8), Alumina (pH ), Bonded Diol, and NH2 Mobile Phase: Non-polar solvents (Hexane, CHCl3) Applications: Non-polar and semi-polar samples; hexane soluble; positional isomers. 30% Silica Gel 47% Silica based bonded phases Diol Amine Cyano 3% Alumina 20% Chiral Bonded Phases

3 Reversed-Phase HPLC 80% Octadecylsilica (ODS, C18)
Principle: Partition of analytes between mobile phase and stagnant phase inside the pore space + adsorption on the surface of bonded phase. Stationary Phase: Hydrophobic surfaces of moieties bonded on silica (C18, C8, C5, Phenyl, CN) Mobile phase: Methanol or Acetonitrile and Water. Applications: ~80% of all separations done on RP HPLC. 80% Octadecylsilica (ODS, C18) 10% Octylsilica (C8) 5% Butylsilica (C4) 3% Phenyl 2% Cyano (CN)

4 REVERSED PHASE SEPARATION PRINCIPLE
Nonpolar (nonspecific) interactions of analyte with hydrophobic adsorbent surface (-C18, C8, Phenyl, C4) Different sorption affinities between analytes results in their separation More polar analytes retained less Analytes with larger hydrophobic part are retained longer Almost no separation of structural isomers Nonspecific (hydrophobic) interactions are at least ten times weaker than polar small differences in component molecular structure could have a significant effect in their retention Reversed Phase Normal Phase Octane, k’ = Octanol, k’ = 3.5 Nonane, k’ = Nonanol, k’ = 3.3

5 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa.

6 FASE STAZIONARIA: CHIMICA DELLA SILICE
La superficie della silice presenta gruppi silanolici (Si-OH), i gruppi reattivi utilizzati per legare la fase stazionaria al supporto. La composizione in silanoli non è costante e regolare su tutta la superficie della silice. Nella silice di tipo A (di origine naturale) la presenza di metalli come impurezze causa ulteriore variabilità nella reattività dei silanoli. La silice di tipo B (di origine sintetica) ha una composizione più controllata.

7 FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE
OH FASE STAZIONARIA LIQUIDA La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro). L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile. SUPPORTO SILICEO

8 FASE STAZIONARIA: DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE
Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoli che non reagiscono sono spesso chiamati “silanoli liberi”. Questo fenomeno è tanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18). Il grado di ricopertura, espresso in mol/m2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella. Si O OH

9 DISATTIVAZIONE DELLA SILICE (ENDCAPPING)
I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di “end-capping” utilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silani come il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inacessibili alle molecole di soluto. Si O OH

10 FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA
In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

11 SCELTA DELLA FASE MOBILE
La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

12 SCELTA DELLA FASE MOBILE
Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

13 LA COLONNA CROMATOGRAFICA
Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

14 SCELTA DELLA FASE STAZIONARIA

15 ION SUPPRESSION R-COOH R-COO- + H+ ION PAIRING R-NH3+ -OOC-R
Molecola con gruppo carbonilico carico Molecola polare non carica ION PAIRING R-NH R-COO- R-NH3+ -OOC-R Coppia ionica Acido organico aggiunto all’eluente

16 Use of Polar (Acid) Modifiers in Peptide Separations
Aids in peptide solvation Suppresses ionization Provides ion pairing Preferably volatile for sample preparation and LC/MS

17 Why use Trifluoroacetic Acid (TFA)?
Good detection sensitivity Good efficiency Good recovery Volatile mobile phase

18 Tipi di matrici utilizzate
Agarosio E’ un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito da residui alternati di D-galattoso e 3,6-anidro-L-galattoso. Disponibile commercialmente come Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con 2,3-dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A Limiti di esclusione kD. Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unito da legami -1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per l’ utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori. Destrano E’ un polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6 prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. E’ presente in commercio con il nome di Sephadex. La porosita’ dei gel a base di destrano e’ controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dall’ introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione kD Il cosiddetto Sephacryl e’ destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene bisacrilamide. Limiti di esclusione kD. Il Superdex e’ un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio. Poliacrilamide E’ un polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD. Polistirene E’ un polimero di stirene legato con divinilbenzene. Silice E’ un polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso puo’ essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.

19 New Technology Monolithic Silica Columns

20 Traditional Silica "Particle-Based" Column
Individual silica particles High flow resistance: Limits ability to shorten run times High backpressure: Reduces life of pumps, seals, and column Reduced throughput: Long run times Bed splitting and voiding possible: Shortens column life and affects reproducibility, lowers efficiency Onyx™ “Monolithic” Column Monolithic porous silica rod High flow rates: Due to high porosity Low backpressures: Less stress on system and column Increased throughput: Significantly shorter run times No inlet bed settling: Increased reliability, reproducibility, and lifetime, maintains efficiency

21 Cromatografia di Adsorbimento :
Hydroxyapatite Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)2 is a form of calcium phosphate which can be used for the separation and purification of proteins, enzymes, nucleic acids, viruses, and other macromolecules. Hydroxyapatite chromatography can be utilized at any stage in a process from initial capture to final polishing. Hydroxyapatite has unique separation properties and unparalleled selectivity and resolution. It often separates proteins shown to be homogeneous by other chromatographic and electrophoretic techniques. Applications of hydroxyapatite chromatography include separation of monoclonal and polyclonal antibodies of different classes, antibodies which differ in light chain composition, antibody fragments, isozymes, supercoiled DNA from linear duplexes, and single-stranded from double-stranded DNA. Il meccanismo di adsorbimento non e’ ben chiaro, si pensa coinvolga ioni Ca e Pi piu’ interazioni elettrostatiche e dipolo-dipolo

22 Cromatografia di adsorbimento: cromatografia per interazione idrofobica (HIC)
E’ un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicita’ di superficie. I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate  le proteine tendono cosi’ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi’ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici. E’ una cromatografia che e’ vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato. L’ eluizione puo’ essere fatta con forza ionica decrescente oppure per ‘spiazzamento’ con detergenti non ionici com ad es. Tween 20, Triton X-100. Potenziali svantaggi: - in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione - non e’ predicibile, puo’ applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre

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24 Cromatografia di partizione: cromatografia chirale
Gli enantiomeri hanno proprieta’ fisiche e chimiche identiche ma vengono riconosciuti in modo differente dai sistemi biologici. Fino a anni fa era impossibile risolvere miscele di enantiomeri, il che costituiva un impedimento notevole allo sviluppo dell’ industria farmaceutica e dell’ uso clinico dei farmaci. 1) trasformazione degli enantiomeri in diastereoisomeri con un agente derivatizzante chirale: (R + S) R’  RR’ + SR’ miscela di agente miscela dei enantiomeri derivatizzante diastereoisomeri 2) fase mobile chirale 3) fase stazionaria chirale meccanismo  probabilmente interazione a 3 punti tra fase stazionaria ed enantiomero. • Fasi stazionarie di Pirkle : derivati nitrobenzoici di aminoacidi come la fenilglicina che vengono legati alla silice. • Ciclodestrine. • Proteine immobilizzate - si sono rivelate particolarmente adatte per molte applicazioni la AGP (acidic 1-glycoprotein) e la HSA (human serum albumin). Entrambe si trovano nel plasma dove legano i farmaci. La 1-glicoproteina acida tollera concentrazioni di solventi organici relativamente alte, pH alti e bassi, e alte temperature. Il meccanismo con cui operano e’ ancora in gran parte sconosciuto.

25 Separazione degli enantiomeri del GR50360

26 MULTI-DIMENSIONAL SEPARATIONS: AN ALTERNATIVE TO 2-D PAGE
In multidimensional chromatography two (or more) techniques with “orthogonal” properties are combined to achieve higher separation power. MS FIRST DIMENSION: e.g. Size Exclusion, Ion-Exchange SECOND DIMENSION: e.g. Reversed Phase Ion-Exchange

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28 Function Separation of volatile organic compounds
Volatile – when heated, VOCs undergo a phase transition into intact gas-phase species Separation occurs as a result of unique equilibria established between the solutes and the stationary phase (the GC column) An inert carrier gas carries the solutes through the column

29 Components Carrier Gas, N2 or He, 1-2 mL/min Injector Oven Column
Detector

30 Sample Introduction (continued):
A sample can be introduced in several ways, the most common being with a direct insertion probe or by infusion through a capillary column. Samples are often introduced using a direct insertion probe or a capillary column. The probe and capillary carry the sample into the vacuum of the mass spectrometer. Once inside the mass spectrometer, the sample is exposed to the ionization source

31 Injector Syringe Detector Gas tank Column Oven

32 Injector A GC syringe penetrates a septum to inject sample into the vaporization camber Instant vaporization of the sample, 280 C Carrier gas transports the sample into the head of the column Purge valve controls the fraction of sample that enters the column

33 Splitless (100:90) vs. Split (100:1)
Injector Syringe Purge valve open closed He He GC column GC column

34 Split or splitless Usually operated in split mode unless sample limited Chromatographic resolution depends upon the width of the sample plug In splitless mode the purge valve is close for s, which means the sample plug is seconds As we will see, refocusing to a more narrow sample plug is possible with temperature programming

35 Open Tubular Capillary Column
0.32 mm ID Mobile phase (Helium) flowing at 1 mL/min Liquid Stationary phase 0.1-5 mm 15-60 m in length

36 Oven Programmable Isothermal- run at one constant temperature
Temperature programming - Start at low temperature and gradually ramp to higher temperature More constant peak width Better sensitivity for components that are retained longer Much better chromatographic resolution Peak refocusing at head of column

37 Typical Temperature Program
60 Time (min)

38 Cromatografia gas-liquido (GLC)
Questa tecnica si basa sulla ripartizione di composti tra una fase liquida e una gassosa. E’ ampiamente utilizzata nell’ analisi quantitativa e qualitativa di un gran numero di sostanze per elevata sensibilita’, riproducibilita’, risoluzione, velocita’. Particolarmente adatta per composti a basso grado di polarita’. (I composti polari - ad es. ac. grassi, carboidrati, aminoacidi - vengono derivatizzati per aumentarne la volatilita’ - metilazione, silanizzazione, perfluoroacilazione) Le colonne sono lunghe di solito 1-3m, ma anche fino a 100m, il diametro e’ di pochi mm.

39 Matrice : la piu’ usata e’ polvere di diatomee impregnata di fase stazionaria
Fase stazionaria : liquido ad alto punto di ebollizione (ad esempio olio di silicone: di cui si puo’ variare la polarita’ sostituendo ad es. con o con Fase mobile : gas inerte (azoto, elio, argon) in cui sono volatilizzati i composti da separare mantenuti allo stato gassoso dall’ alta temperatura. Nella GLC i coefficienti di partizione sono strettamente dipendenti dalla temperatura. Il sistema di rivelazione piu’ diffuso e’ il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID flame ionisation detector). Anche spettrometro di massa. Prima dell’ HPLC la GLC era la forma di cromatografia piu’ diffusa.

40 Stationary Phases Detectors
Must have: (1) low volatility (2) thermal stability (4) chemical inertness (5) solvation properties giving suitable values for k’, a. Commonest are polysiloxanes: Nature of R varied to give different polarities. e.g. All R = Me : non-polar column. Best for non-polar analytes (hydrocarbons, PAH’s etc.) or R = 50% Me, 50% cyanopropyl - increased polarity - best for alcohols, acids etc. Greater polarity from polyethylene glycols: Detectors will discuss these later (and applications of GC in real analytical problems).

41 GAS CROMATOGRAFIA (GC)

42 RIVELATORI PER GC

43 General Elution Problem in GC
(a) - low temperature (450C) - good resolution initially - but too slow later. (b) - higher temperature (145oC) - much faster but poor resolution for early-eluting species. In general - best results for temperatures near boiling point of analyte. If there is a wide range of boiling points in the sample - then the best results \re obtained by temperature programming as shown in (c), for the same mixture, where the temperature steps are as shown.

44 GC GC-MS Kopplung