TERAPIA GENICA Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un difetto genetico ereditato o acquisito o per introdurre.

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1 TERAPIA GENICA Trasferimento di geni esogeni in cellule somatiche di un paziente per correggere un difetto genetico ereditato o acquisito o per introdurre nuove funzioni o proprietà.

2 TERAPIA GENICA Speculazioni sulla possibilità di effettuare una terapia genica sono degli anni ’60 Primo trial clinico approvato in USA nel Primo trial clinico in Italia per la correzione del deficit di adenosina deaminasi (14 settembre 1992) al 2001: 596 clinical trials di terapia genica (3464 pazienti) al 2007: circa 650 clinical trials di terapia genica (problemi inefficacia, tossicità)

3 Gene Therapy to be possible?
What is required for Gene Therapy to be possible? 1) Understanding of the disease process 2) Structure/function of gene to be introduced 3) Animal model and assessment of function 4) Efficient delivery of gene 5) Control of gene expression 6) Prevention/control of immune responses 7) Clinical trial

4 TERAPIA GENICA-applicazioni
Malattie ereditarie (es. distrofia muscolare, fibrosi cistica) per far esprimere la proteina mancante Malattie neoplastiche in cui i geni introdotti possono contribuire a distruggere le cellule neoplastiche Alterazioni del sistema immunitario per modificare la risposta immune Malattie infettive per potenziare i meccanismi di difesa

5 Gene Transfer: getting genes into cells
Two main routes: In vivo: i.v. or i.m. injectable; or non-invasive (eg “sniffable”) Ex vivo: hepatocytes, skin fibroblasts haematopoietic cells

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7 Gene delivery approaches
Physical methods Non-viral vectors Viral vectors

8 Physical methods Injection of naked DNA
Electroporation in vivo or ex vivo Ballistic technology – the “gene gun”

9 Effect of Electric Field on Cell Membrane

10 genetically engineered
Ex vivo electroporation cells obtained from skin biopsy cells are reinjected gene introduced into cells by electroporation genetically engineered cells are propagated

11 Gene Gun

12 Metodi fisici Vantaggi Svantaggi Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene Scarsamente efficiente se non per certi tipi cellulari Reazioni immunitarie per DNA batterico Solo per tessuti superficiali Scarsa penetrazione nelle cellule per l’elevata carica negativa ad eccezione di cellule muscolari scheletriche e miocardiche, alcuni tipi di tumori, cute, cellule epatiche, ghiandola tiroidea. Reazione immunitaria Esposizione chirurgica del tessuto

13 Metodi fisici Strategie per migliorare l’efficienza:
associazione del DNA a polimeri cationici (pol. lineari, es. poli-lisine; pol.ramificati, es. polietilenimine o PEI; pol. sferoidali, es. poliamidoamine)

14 Vettori non virali -Liposomi
Vescicole sferiche costituite da un doppio strato fosfolipidico idrofilico idrofobico

15 Liposome-mediated Gene Transfer
complex DNA endocytosis nucleus membrane fusion

16 Liposomi Vantaggi Svantaggi Nessuna limitazione per numero e dimensione del gene Facili da produrre Scarsa tossicità (?) Efficienza modesta Espressione a breve termine Scarsa penetrazione nelle cellule per l’elevata carica negativa ad eccezione di cellule muscolari scheletriche e miocardiche, alcuni tipi di tumori, cute, cellule epatiche, ghiandola tiroidea. Reazione immunitaria Esposizione chirurgica del tessuto

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18 TERAPIA GENICA Caratteristiche ideali di un vettore per terapia genica: produzione ad elevate concentrazioni con metodo facile e riproducibile; transgene regolato dai suoi elementi di regolazione; abilità di raggiungere specifici tipi cellulari; mancata stimolazione di risposta immunitaria da parte dell’ospite

19 TERAPIA GENICA Integrazione del transgene Vantaggi:
perpetuo; può consentire un’espressione stabile ed una cura. Svantaggi: un’inserzione random può rendere silente il transgene o disregolare geni dell’ospite effetti a lungo termine (?)

20 TERAPIA GENICA Transgene episomale Vantaggi:
assenza di mutagenesi inserzionale o effetti a lungo termine. Svantaggi (?): espressione transiente; necessità di trattamenti ripetuti

21 Vettori virali Quelli utilizzati per terapia genica sono modificati affinchè possano infettare cellule di mammifero, ma non siano in grado di replicarsi. Retrovirus Adenovirus Lentivirus Adeno-associated virus Herpes simplex virus

22 Engineering a Virus into a Vector
Therapeutic gene Packaging Vector DNA Helper DNA essential viral genes wildtype virus replication proteins Viral vector Packaging cell structural proteins Based on Kay et al 2001

23 RETROVIRUS RNA virus di circa 10 kb con conversione di RNA a DNA mediante una trascrittasi inversa Vettori principalmente utilizzati sono derivati dal virus Moloney della leucemia murina. transgene si integra stabilmente in cellule in mitosi inattivato dal complemento

24 RETROVIRUS Potenziale tossicità:
generazione di virus replicazione-competenti (per ricombinazione in fase di produzione o nell’ospite) mutagenesi inserzionale (tumori?)

25 LENTIVIRUS Vettori retrovirali descritti per la prima volta nel ’96
Basati sul virus HIV-1 Possono transdurre anche cellule non in divisione Potenziale tossicità: Simile a retrovirus con l’aggravante che si tratta di un patogeno per l’uomo (studio di lentivirus felini o equini)

26 ADENOVIRUS DNA virus di circa 36 kb causano infezioni benigne del tratto respiratorio; infettano cellule in divisione e non; facili da produrre in grande quantità; ospitano geni di grandi dimensioni; entrano nelle cellule mediante endocitosi; trasgene episomale;

27 ADENOVIRUS Effetti sfavorevoli: Espressione a breve termine
Reazioni infiammatorie Risposta immune dell’ospite: cellulare (prod. di linfociti T contro le cellule infettate) umorale (prod. di anticorpi che preclude altri trattamenti) Tossicità acuta

28 ADENO-ASSOCIATED VIRUS
DNA virus non patogeni che richiedono adenovirus o herpesvirus per replicare Infettano cellule in divisione e non Può ospitare transgeni non superiori a 4.5 kb Integrazione del transgene Inserzione sito-specifica nel cromosoma 19 (?)

29 FIBROSI CISTICA Malattia a carattere autosomico recessivo causata da mutazioni della proteina transmembrana CFTR coinvolta nel trasporto degli ioni Cloro nelle cellule epiteliali di vari organi. CFTR Alterazione di CFTR causa accumulo di muco denso e viscoso nei polmoni e alterazioni funzionali in fegato, pancreas, organi riproduttori Terapia sintomatica.

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31 Risultati sperimentali:
CFTR -terapia genica Necessità di intervenire in vivo Risultati sperimentali: Topo KO (patologia polmonare modesta) instillazione tracheale di liposoma-CFTR: promettente Tossicità vettori virali testata su diverse specie animali risultato variabile

32 CFTR -terapia genica Studi clinici (instillazioni tracheali o spray nasale): Liposoma -CFTR: bassa efficienza di trasfezione e di breve durata Adenovirus-CFTR: prima generazione problemi infiammatori e reazioni anticorpali; scarsa efficacia; seconda generazione meglio tollerati, scarsa e breve espressione AAV-CFTR: ben tollerato, ma espressione breve PEG-poliK-DNA: nessuna tossicità, effetto per 6 giorni Potenziali sviluppi futuri: cellule staminali eterologhe o modificate geneticamente

33 ADA deficiency Malattia a carattere autosomico recessivo causata da deficit o alterata funzionalità dell’enzima Adenosina deaminasi, coinvolto nel metabolismo delle purine. Conseguenze: accumulo di dATP, dADP, dAMP; blocco produzione linfociti T, NK, B; difetti scheletrici, disturbi comportamentali, alterazioni rene-fegato. Patologia letale per grave immunodeficienza.

34 Possibilità terapeutiche:
ADA deficiency Possibilità terapeutiche: Trapianto di midollo Terapia sostitutiva: PEG-ADA bovino i.m. 1-2/sett.; problemi compliance, non-responders (15-20%) Terapia genica ex-vivo

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36 Terapia genica - ADA deficiency
In linfociti T periferici: risultati soddisfacenti ottenuti con sospensione di PEG-ADA vantaggi: fattibilità e sicurezza; linfociti T ingegnerizzati vivono a lungo; limiti: ripristino funzionalità confinata ai linfociti T; necessità di infusioni ripetute.

37 Terapia genica - ADA deficiency
In cellule staminali del midollo osseo: Protocollo- Studio effettuato in due bambini di 6 mesi e 30 mesi Sospensione PEG-ADA. Cellule prelevate dal midollo osseo e infettate con vettore retrovirale Moderata mieloablazione con Busulfan (2mg/kg/die per 2 gg) due e tre giorni prima del reimpianto Risultati a 360 giorni: Ripristino linfociti B, T, NK e crollo livelli metaboliti purinici nel paziente più giovane. Buoni risultati solo a carico di linfociti T e NK nel secondo paziente.

38 SCID-X1 (severe combined immunodeficiency disease) Malattia ereditaria legata al cromosoma X Grave immunodeficienza caratterizzata dalla mancata maturazione dei linfociti T e NK Terapia genica ex-vivo con vettori retrovirali in cellule staminali ematopoietiche. Dopo tre anni, sviluppo di leucemia dei linfociti T in due bambini (mutagenesi inserzionale al locus LMO-2, cromosoma 11) Ad oggi 4 casi documentati

39 OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO

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41 Struttura modificata per aumentare la
resistenza alle nucleasi: oligonucleotidi fosforotioati (stabilità in vitro, buona emivita)

42 OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO
Problematiche: Specificità Legame a fattori di crescita e loro recettori (es. PDGF, VEGF, EGFR) Tossicità pre-clinica : nei roditori immunostimolazione e degenerazione tubulare renale e epatica (alte dosi); nelle scimmie inibizione cascata della coagulazione, attivazione cascata del complemento

43 OLIGONUCLEOTIDI ANTISENSO:
applicazioni Vitravene (Fomivirsen) - Novartis - Primo oligonucleotide antisenso approvato in terapia (FDA,1998). Distributo in USA, Europa, Brasile Indicazioni terapeutiche: trattamento locale di retinite da CMV in soggetti con AIDS Bersaglio: sequenza di mRNA della regione IE2 del CMV essenziale per infettività Tossicità: infiammmazione, aumento di pressione intraoculare, danni alla retina

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46 APTAMERI

47 PEGAPTANIB - Macugen® (Eyetech Pharm./Pfizer)
RNA aptamero diretto contro il vascular endotelial growth factor (VEGF)-165, isoforma responsabile di neovascolarizzazione oculare patologica e permeabilità vascolare; Indicazione terapeutica: degenerazione maculare associata all’età

48 struttura e sede di legame
PEGAPTANIB struttura e sede di legame Modificazioni che aumentano la stabilità (O-met), affinità (F), emivita (PEG). dT =deossiTimidina Purine 2’-O-metilate Heparin-binding domain VEGF Pirimidine 2’-fluorurate

49 APTAMERI Selettività Scarsa tossicità (?) Disponibiltà di “antidoti”
Alternativa all’uso di anticorpi (?) Potenziali applicazioni: infezioni, cancro, patologie cardiovascolari