METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A CAMPIONI PARAFFINATI DI

Presentazione sul tema: "METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A CAMPIONI PARAFFINATI DI"— Transcript della presentazione:

1 METODICHE MOLECOLARI APPLICATE A CAMPIONI PARAFFINATI DI
TUMORI DELLA EWING FAMILY (EFT) A. Parafioriti(1), S. Del Bianco(1), E. Armiraglio(1), S.Mapelli(2) U.O. Anatomia Patologica; (2) Centro di Chirurgia Ortopedica Oncologica Istituto Ortopedico Gaetano Pini - Milano

2 Sarcoma di Ewing Tumore maligno dell’osso più comune in età pediatrica dopo l’osteosarcoma con prognosi legata a : presentazione localizzata (70 % sopravvivenza) metastatica (30% sopravvivenza) Descritto da J. Ewing nel 1920 e rimasto per decenni ad istogenesi incerta. Oggi sappiamo che ha origine neuroectodermica e che insieme al Tumore di Askin ed ai Tumori neuroectodermici primitivi (PNET) costituiscono un gruppo chiamato EFT con caratteristiche istologiche, immunofenotipiche, genetiche comuni.

3 Caratteristiche citogenetiche
Il sarcoma di Ewing presenta delle traslocazioni cromosomiche peculiari: t(11;22) nel 70% dei casi t(21;22) nel 10% dei casi t(7;22) nel 5% dei casi t(17;22) ed altre… La traslocazione più frequente t(11;22)(q24;q12) produce un gene chimerico EWS/FLI1 che codifica per una proteina espressa nel 90% dei EFT.

4 Riscontro delle traslocazioni
L’identificazione delle traslocazioni è importante: per motivi diagnostici (diagnosi differenziale dei tumori a piccole cellule Ewing-like) - per motivi prognostici/predittivi (valutazione di malattia residua a livello midollare e plasmatico).

5 Scopo dello studio Abbiamo applicato routinariamente la metodica RT-PCR che permette di rilevare la presenza dei trascritti di fusione più comuni EWS/FLI1 e EWS/ERG in sezioni tumorali paraffinate di pazienti portatori di EFT dello scheletro. L’accurata scelta dei primers ha reso possibile, con un’unica amplificazione, la discriminazione tra i due sottotipi del trascritto EWS/FLI1. Alcuni casi sono stati tipizzati anche con metodica di Real-Time PCR (qRT-PCR).

6 Metodi L’analisi è stata condotta su 53 campioni di sarcoma EFT dell’osso. L’RNA è stato estratto da sezioni paraffinate con un kit commerciale Il risultato dell’estrazione è stato valutato allo spettrofotometro ottenendo valori di ratio e resa. Due microgrammi di RNA sono stati retrotrascritti in cDNA ed è stata effettuata una PCR sul gene housekeeping PGK per verificare la buona qualità del cDNA.

7 Metodi La PCR standard è stata condotta amplificando circa 200 ng di cDNA ed utilizzando una coppia di primers in grado di discriminare i due sottotipi di trascritto di fusione. Su 5 campioni di cui 3 risultati negativi in PCR standard è stata condotta un’analisi di Real-Time PCR utilizzando il metodo del SYBR green con la stessa coppia di primers usata in PCR standard.

8 Risultati La tipizzazione dei pazienti per il trascritto di fusione EWS/FLI1 ha fornito i seguenti risultati: EWS/FLI1 tipo 1 36 EWS/FLI1 tipo 2 6 Nessun trascritto 7 RNA degradato 4 Totale 53 Di 5 pazienti analizzati mediante q RT- PCR: 3 confermati negativi 2 positivi per EWS/FLI1

9 Lane A e D = trascritto EWS/FLI1 tipo 1
PCR standard Lane A e D = trascritto EWS/FLI1 tipo 1 Lane B e E = trascritto EWS/FLI1 tipo 2 Lane C = nessun trascritto Lane F = marcatore 25bp Lane G = marcatore 100bp A B C D E F G

10 Vantaggi della Real-Time PCR
La rilevazione dei trascritti di fusione tramite metodica di RT- PCR può essere utile come supporto alla diagnosi degli EFT Accresce enormemente la sensibilità dell’analisi minimizzando il rischio di falsi positivi. Non richiede ulteriori indagini post-PCR per la visualizzazione dei risultati (elettroforesi su gel di agarosio) e la verifica della loro identità (sequenziamento).

11 Conclusioni La caratterizzazione citogenetica dei tumori appartenenti alla EFT integra i dati morfologici ed immunofenotipici della diagnosi istopatologica, al fine di una classificazione sempre più accurata, della possibilità di identificare sottogruppi di pazienti con prognosi diversa o riprese di malattia altrimenti non ancora “detectable”.