Di che cosa abbiamo bisogno?

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1 Di che cosa abbiamo bisogno?
PRINCIPI DI BASE Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B0 Un trasmettitore di radiofrequenza M Piccioli R.M.B. Biotec

2 PRINCIPI DI BASE Parole Chiave Esperimenti in Onda continua ed in
Trasformata di Fourier M Piccioli R.M.B. Biotec

3 M Piccioli R.M.B. Biotec

4 Thank you, Mr. Fourier! F(n) F(t) M Piccioli R.M.B. Biotec

5 M Piccioli R.M.B. Biotec

6 FOURIER TRANSFORMATIONS
F(n)=d(n0) F(n)=At(sinpvt)/pvt centered at n0 F(t)=exp(-t/T2) F(n)=T2/1+(2pnT2)2 -i 2pn(T2)2/1+(2pnT2)20 F(t)=exp(-t/T2)exp(i2pnA) F(n)=T2/1+(2p(n-nA)T2)2 -i 2p (n-nA)(T2)2/1+(2p (n-nA) nT2)20 FOURIER TRANSFORMATIONS M Piccioli R.M.B. Biotec

7 The FT allows to determine the frequency content of a squared function
Why bother with FT? FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function (deconvolution). In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum) The FT allows to determine the frequency content of a squared function M Piccioli R.M.B. Biotec

8 Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR
Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma anche tutte le frequenze intorno Tanto piu’ l’impulso è corto e tanto più è largo il range di frequenze eccitate Una somma di onde, puo’ essere decomposta nelle singole onde che l’hanno generata e puo’ essere convertita in una serie di frequenze La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioni M Piccioli R.M.B. Biotec

9 A “real” F.I.D. M Piccioli R.M.B. Biotec

10 The NMR Experiment z y x M B1 90° t wI I t
To have a spin transition, a magnetic field B1 , oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium z y x M B1 90° t wI I t The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID.

11 PRINCIPI DI BASE Parole Chiave Impulso Trasformata di Fourier

12 PRINCIPI DI BASE Parole Chiave Frequenza di Larmor
Precessione del segnale (evoluzione del Chemical shift)

13 Esperimento NMR Consideriamo solo un singolo spin.
Per esempio un campione contenente solo H2O Lo stato del sistema all’equilibrio Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare l’esperimento

14 Esperimento NMR L’effetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dall’equilibrio La magnetizzazione di H2O è ruotata. Tanto piu’ lungo è l’impulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

15 Importante Il segnale osservato nell’esperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

16 Esperimento NMR IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

17 Segnale ricevuto My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0
Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo). Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0 Frequency (n)

18 Segnale ricevuto My=cos(nobs)texp(t/T2) Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dell’impulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza nobs=(n1-n0) My=cos(nobs)texp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation n=0 n=nobs Frequency (n)

19 Free Induction Decay (FID)
Observed NMR signal in the time domain Resonance frequencies are acquired as a function of time t t t Common case of observed FIDs

20 Preparation Detection z t2 y w0 x FT relax. M Piccioli R.M.B.
Biotec

21 Signal to noise Scans S/N 1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00
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22 Sensibilità dell’Esperimento NMR
S/N  N g5/2 B03/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale g rapporto giromagnetico del nuclide studiato B Camp magnetico utlizizzato M Piccioli R.M.B. Biotec

23 The NMR spectrometer Magnet Probe Coils Transmitters
Amplifiers and pre-amplifiers Receiver ADC

24 The NMR spectrometer

25 The Magnet History First magnets were built using
ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire. A “cutted” magnet

26 Cryomagnets Superconducting wire
has a resistance approximately equal to zero when it is cooled to a temperature close to absolute zero ( o C or 0 K) by emersing it in liquid helium. Once current is caused to flow in the coil it will continue to flow for as long as the coil is kept at liquid helium temperatures. The length of superconducting wire in the magnet is typically several miles.

27 Magnet

28 The Probe The sample probe is the name given to that part of the spectrometer which accepts the sample, sends RF energy into the sample, and detects the signal emanating from the sample. It contains the RF coil, sample spinner, temperature controlling circuitry, and gradient coils. Picture an axial cross section of a cylindrical tube containing sample. In a very homogeneous Bo magnetic field this sample will yield a narrow spectrum

29 B0 homogeneity In a more inhomogeneous field the sample will yield a broader spectrum due to the presence of lines from the parts of the sample experiencing different Bo magnetic fields.

30 Ubiquitin 76 amino acids, 8,5 kDa M Piccioli R.M.B. Biotec

31 1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates
Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn? M Piccioli R.M.B. Biotec

32 Occorrono informazioni strutturali, e correlazioni tra i vari spin che permettano l’assegnamento.
Per ottenere cio’ é necessario osservare tutti i possibili accoppiamenti scalari e dipolari. M Piccioli R.M.B. Biotec

33 NMR MULTIDIMENSIONALE
Gli spettri NMR monodimensionali permettono questo solo per molecole semplici e di basso peso molecolare. All’aumentare del PM, diventa impossibile individuare tutti gli accoppiamenti scalari dall’analisi dei multipletti e tutti gli accoppiamenti dipolari dagli esperimenti NOE monodimensinoali. NMR MULTIDIMENSIONALE M Piccioli R.M.B. Biotec

34 The need for multidimensional NMR
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35 COSA SIGNIFICA Spettro NMR BIDIMENSIONALE
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36 Cosa è un esperimento bidimensionale ?
Dopo un impulso a 90° il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta, Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione M Piccioli R.M.B. Biotec

37 Aq F2 Aq F1 wA (F1) wA (F2) wA (F1) HA HA wA (F1) wB (F2) HB
PREPARAZIONE-ACQUISIZIONE t1- PERTURBAZIONE- ACQUISIZIONE (t2) 90° Aq F2 Aq F1 wA (F1) wA (F2) wA (F1) HA HA wA (F1) wB (F2) HB M Piccioli R.M.B. Biotec

38 Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari
Perché la magnetizzazione di uno spin dovrebbe trasferirsi su quella di un altro spin? Perché ci sono gli accoppiamenti scalari e gli accoppiamenti dipolari M Piccioli R.M.B. Biotec

39 Eccito (impulso a 90°)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata M Piccioli R.M.B. Biotec

40 Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà l’informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2) M Piccioli R.M.B. Biotec

41 EXAMPLE O H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

42 EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm H H N C Spectrum before
This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

43 EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling H H N C
This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

44 EXAMPLE O H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same !
Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

45 EXAMPLE O H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Hn
Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling M Piccioli R.M.B. Biotec

46 The second dimension = t2
The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2 M Piccioli R.M.B. Biotec

47 Usually t1 is also defined as indirect dimension
t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2 M Piccioli R.M.B. Biotec

48 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies
Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies M Piccioli R.M.B. Biotec

49 Accoppiamento scalare
L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY M Piccioli R.M.B. Biotec

50 COrrelation SpectroscopY
Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY M Piccioli R.M.B. Biotec

51 COrrelation SpectroscopY
Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ 2 4 3 H4-H5 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1 M Piccioli R.M.B. Biotec

52 Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment
It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING M Piccioli R.M.B. Biotec

53 Accoppiamento dipolare
L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A M Piccioli R.M.B. Biotec

54 Accoppiamento dipolare
L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore M Piccioli R.M.B. Biotec

55 Through space AND throuhg bonds
Through bond M Piccioli R.M.B. Biotec

56 Quando lo spettro è troppo affollato di segnali, non è possibile fare esperimenti monodimensionali, perché non tutti i segnali sono disttinguibili dagli altri E’ quindi necessario u nesperimento bidimensionale, ovvero un esperimento che permette di trasferire la magnetizzazinoe da uno spin all’altro utilizzando l’accoppiamento dipolare M Piccioli R.M.B. Biotec

57 Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY
Example: Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY NOESY NOE Effect: If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetization AA AB M Piccioli R.M.B. Biotec

58 Example: The real case:
Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacids NOESY experiment Cross peaks: A and B are close Diagonal peak AA AB M Piccioli R.M.B. Biotec

59 2D NOESY Spectrum M Piccioli R.M.B. Biotec

60 Distance constraints mJ B0 mI q r
NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r M Piccioli R.M.B. Biotec

61 The “old times” approach
NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn M Piccioli R.M.B. Biotec

62 M Piccioli R.M.B. Biotec

63 La Spettroscopia NMR che utilizza sono spin 1H è solo un caso particolare della spettroscopia NMR bidimensinoale In effetti, accoppiamenti scalari e dipolari sono possibili anche tra spin diversi, es 1H e 13C 1H e 15N 13C e 15N 13C e 13C M Piccioli R.M.B. Biotec

64 In particolare, gli esperimenti che utilizzano accoppiamenti scalari tra spin diversi permettono di usare le 1J che di solito hanno valori maggiori e quindi danno esperimenti piu’ sensibili. Sarà pertanto possibile effettuare esperimenti bidimensionali dove in ciascuna delle due dimensioni si acquisicono nuclei diversi, per esempio 13C e 1H Otterremo un segnale nello spettro SE E SOLO SE abbiamo nel nostro sistema due spin (1H e 13C) che sono tra di loro accoppiati. M Piccioli R.M.B. Biotec

65 Questi esperimenti offrono molti vantaggi e aprono molte possibilità:
Spin 1H e 13C potranno essere direttamente accoppiati tra di loro aiutando la identificazione dei varigruppi e semplificando l’assegnamento 2. Ogni picco permette di individuare due spin, semplificando il problema della identificazione dei segnali Un esperimento bidimensionale offre una risoluzione molto maggiore perchéi segnali non sono separati solo in una dimensionale ma in una matrice bidimensionale, permettendo cosi’ l’analisi di sistemi anche piu’ complessi e non risolvibili in 1D M Piccioli R.M.B. Biotec

66 1J couplings for backbone resonances
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67 1J couplings for backbone resonances
M Piccioli R.M.B. Biotec

68 The 2D Hetcor experiment
Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

69 The 2D Hetcor experiment
Two dimensional Heteronuclear correlation Experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

70 E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)
’ possibile, combinare questa possibilità con ciò che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato M Piccioli R.M.B. Biotec

71 E’ possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)
Inoltre possiamo combinare tutto cio’ con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali M Piccioli R.M.B. Biotec

72 2D HETCOR Expriment Eccito (impulso a 90°) 1H Acquisisco (t1) 1H –
Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t2) 13C M Piccioli R.M.B. Biotec

73 2D HETCOR Expriment M Piccioli R.M.B. Biotec

74 2D HETCOR Expriment Prima dimensione M Piccioli R.M.B.
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75 2D HETCOR Expriment Prima dimensione M Piccioli R.M.B.
Biotec

76 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione M Piccioli
R.M.B. Biotec

77 2D HETCOR Expriment Prima dimensione Seconda dimensione M Piccioli
R.M.B. Biotec

78 M Piccioli R.M.B. Biotec

79 Esempio COSY M Piccioli R.M.B. Biotec

80 Esempio COSY N.B. In questo caso non si osserva solo l’accoppiamento 3J ma si osserva una “propagazione” dell’informazione attraverso gli accoppiamenti scalari M Piccioli R.M.B. Biotec

81 Esempio HETCOR 4 3 1 5 2 M Piccioli R.M.B. Biotec

82 2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli
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83 2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence M Piccioli
R.M.B. Biotec

84 2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence
Seconda dimensione Prima dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

85 2D HSQC Expriment Heteronuclear Single Quantum coherence
Prima dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

86 2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence
Seconda dimensione Prima dimensione M Piccioli R.M.B. Biotec

87 2D HSQC Experiment Heteronuclear Single Quantum coherence
E’ possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo all’altro anche indipendentemente dall’acquisizione Seconda dimensione Prima dimensione In questo esperimento il primo spin che viene eccitato è 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi è 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati! Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre l’accoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H M Piccioli R.M.B. Biotec

88 2D HSQC Experiment Eccito (impulso a 90°) 1H Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t1) 13C – Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13C a 1H utilizzando l’accoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t2) 1H M Piccioli R.M.B. Biotec

89 2D HSQC Experiment Questo tipo di esperimento si chiama anche
Out and back Significa che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito Il doppio trasferimento fa si che l’esperimento sia molto piu’ selettivo Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1J M Piccioli R.M.B. Biotec

90 The HSQC experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

91 Caratteristiche dell’esperimento HSQC
Non esiste la diagonale La magnetizzazione viene trasferita da 1H al 13C ad esso accoppiato Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13C Infine si ri-trasferisce su 1H e si osserva 1H Tutti gli 1H che non sono accoppiati a 13C NON si osservano

92 Heteronuclear NMR Transfer the information to all 1H coupled
OBSERVE 13C during t1 Transfer the information to all 1H coupled OBSERVE 1H during t2 13C No more diagonal Each peak indicate A different H-C pair M Piccioli R.M.B. Biotec 1H

93 Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1
Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal CH2 Two protons are bound to the same carbon 13C M Piccioli R.M.B. Biotec 1H

94 The HSQC experiment M Piccioli R.M.B. Biotec

95 Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings M Piccioli
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96 The 1H- 15N HSQC experiment
Heteronuclear Single Quantum Coherence M Piccioli R.M.B. Biotec

97 The HSQC experiment Detect H-N couplings
Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job) M Piccioli R.M.B. Biotec

98 Heteronuclear NMR in proteins example: 15N labelled proteins
M Piccioli R.M.B. Biotec

99 Heteronuclear NMR in proteins example: 15N labelled proteins
M Piccioli R.M.B. Biotec

100 The HSQC experiment Detect H-N couplings
Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak M Piccioli R.M.B. Biotec

101 The role of metal cofactor in protein unfolding
Metal triggered protein folding Apo 3.3 M GdmCl 3.3 M GdmCl Ca2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding M Piccioli R.M.B. Biotec

102 Apo vs holo protein, mapping the environment of the metal ion
95 77 60 20 59 HNd 28 35 15 6 26 7 90 45 96 HNe 32 75 72 94 33 37 13 12 8 3 78 65 28 34 100 88 23 41 36 46 83 64 27 80 89 99 14 48 62 84 21 17 43 24 25 74 29 86 30 79 47 51 58 16 42 87 22 4 11 98 39 10 76 81 69 97 53 93 56 91 101 40 67 57 19 38 71 52 54 55 68 85 66 82 5 HNe1 83 102 15H M Piccioli R.M.B. Biotec M Piccioli R.M.B. Biotec

103 The need for multidimensional NMR

104 Troppi segnali 1H ? M Piccioli R.M.B. Biotec

105 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H 15N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY M Piccioli R.M.B. Biotec

106 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H protein size >20000 15N and 13C Scalar couplings through 13C atoms -triple resonance -assignment -structure M Piccioli R.M.B. Biotec