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MISURA DEI SEGNALI INTRACELLULARI DI Ca 2+ (Microscopia ad epiflurescenza)

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Presentazione sul tema: "MISURA DEI SEGNALI INTRACELLULARI DI Ca 2+ (Microscopia ad epiflurescenza)"— Transcript della presentazione:

1 MISURA DEI SEGNALI INTRACELLULARI DI Ca 2+ (Microscopia ad epiflurescenza)

2 Step 2 STATO ECCITATO: Lo stato eccitato permane per un breve lasso di tempo (1-10 x sec), durante il quale dissipa parte dellenergia assorbita a causa di moti vibrazionali, passando ad uno stato eccitato S 1 (detto singoletto rilassato) a energia lievemente inferiore rispetto a S 1. Step 3 FLUORESCENZA: il fluoroforo ritorna al livello fondamentale S o in seguito ad emissione di un fotone di energia h em A causa della parziale dissipazione di energia durante lo stato eccitato, lenergia del fotone emesso è minore rispetto a quella del fotone assorbito, pertanto la lunghezza donda è maggiore. Step 1 ECCITAZIONE: Quando un fluoroforo (una sostanza in grado di produrre il fenomeno della fluorescenza) assorbe un fotone di energia h ex passa dal livello fondamentale S0 ad un livello elettronico eccitato S1 (detto singoletto). La fluorescenza Diagramma di Jablonsky

3 h ex – h em = spostamento di Stokes E ex E em

4 Started with EGTA, the first chelator shown to have high selectivity for Ca2+ over Mg2+ (~105). Binding of Ca2+ is 1:1. BAPTA made by converting aliphatic amino groups of EGTA into aromatic amino groups. BAPTA retains high selectivity for Ca2+ over Mg2+ I fluorofori per il Ca 2

5 Coloranti raziometrici: il Fura-2 Il FURA-2 manifesta la singolare caratteristica di subire uno spostamento dello spettro di assorbimento in funzione della [Ca2+] libero In assenza di Ca2+, il fura-2 presenta uno spettro di eccitazione piuttosto ampio, con un picco a circa 380 nm. Quando si lega al Ca2+, lo spettro di eccitazione si sposta ancora di più nellUV: picco a 340 nm. In presenza di Ca2+, quindi, lintensità della fluorescenza emessa dal fura-2 (misurata a 510 nm) aumenta se si eccita a 340 nm (F 340 ) e diminuisce se si eccita a 380 nm (F 380 ).

6 Coloranti raziometrici: il Fura-2 Ne consegue che eccitando alternativamente alle lunghezze donda di 340 nm e 380 nm si raccoglie una coppia di segnali alla lunghezza donda di emissione di 510 nm per ogni punto sperimentale. Effettuando il rapporto dei due valori è possibile, quindi, ottenere una misura che è indipendente dalla concentrazione dellindicatore nel campione.

7 Coloranti a singola : il Fluo-3 Spettri di emissione del Fluo-3 ottenuti eccitando alla lunghezza donda di 488 nm e in presenza di diverse concentrazioni di Ca 2+ libero

8 CALIBRAZIONE RAZIOMETRICA utilizzabile solo con indicatori che presentano shift dello spettro di eccitazione o emissione intensità di fluorescenza misurata a due lunghezze donda (con variazioni opposte del segnale a seguito del legame con il Ca 2+ ) elimina le variabili legate a concentrazione dellindicatore, percorso ottico, intensità di eccitazione, efficienza di rilevazione

9 Free acid forms of BAPTA- based indicators are hydrophobic and do not cross the plasma membrane (can be loaded by microinjection or in a patch pipette). Addition of AM ester groups shields polar features and permits indicators to readily permeate the cell membrane. Once inside, intracellular esterases convert indicators to free acid form which remains trapped inside the cell. Il caricamento delle cellule: acid vs. ester

10 PROBLEMI: compartimentazione idrolisi incompleta dellAM estere perdita di fluoroforo

11 Microscopia a fluorescenza Specchio dicroico Elemento chiave di un microscopio a fluorescenza. Permette di separare la luce di eccitazione da quella di emissione. Esso, infatti, è in grado di riflettere la luce al di sotto di una certa lunghezza donda (lunghezza di taglio) e di essere trasparente alla luce con lunghezze donda superiori. La luce di eccitazione viene, quindi, riflessa verso il preparato, ma solo la luce emessa dal fluoroforo raggiunge gli oculari del microscopio. Xeno Mercurio (o monocromatore)

12 Microscopia a fluorescenza


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