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Laboratorio Professionalizzante di Spettroscopia Prof. Lorenzo Stella Settore 5 Livello 1 Stanza 4 Tel.: 06-7259-4463

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Presentazione sul tema: "Laboratorio Professionalizzante di Spettroscopia Prof. Lorenzo Stella Settore 5 Livello 1 Stanza 4 Tel.: 06-7259-4463"— Transcript della presentazione:

1 Laboratorio Professionalizzante di Spettroscopia Prof. Lorenzo Stella Settore 5 Livello 1 Stanza 4 Tel.:

2 La luminescenza Luminescenza:emissione di luce da atomi, molecole o cristalli eccitati elettronicamente. Eccitazione luminosa: ~ns: fluorescenza ~ms: fosforescenza Eccitazione chimica: Chemiluminescenza

3 Spettroscopia di fluorescenza: Vantaggi sperimentali Elevatissima sensibilità (fino alla singola molecola). Flessibilità di campionamento (anche misure in vivo). Basso costo e semplicità della strumentazione. Informazioni ottenibili Concentrazione della sonda fluorescente (fluoroforo), fino a nM. Ambiente chimico ed accessibilità al solvente del fluoroforo. Dinamica dellambiente del fluoroforo. Dinamica conformazionale e diffusionale della (macro)molecola fluorescente (nei ps- ns). Numero e popolazione di specie presenti in soluzione. Distanza tra due fluorofori Alcuni esempi: Processi di associazione, transizioni conformazionali, transizioni di fase, struttura di peptidi, dinamica di proteine, rilascio di farmaci, sensori e biosensori, pH intracellulare, imaging di cellule, etc. …

4 Il diagramma di Jablonski Conseguenze Stokes shift (spostamento ad energie più basse). Regola di Kasha (invarianza spettrale con la lunghezza donda di eccitazione). Regola dellimmagine speculare. Sensibilità alla dinamica.

5 Tempo di vita dello stato eccitato k r =costante di decadimento radiativo k n.r. =costante di decadimento attraverso i processi non radiativi N * =numero di molecole nello stato eccitato t I

6 Fluorofori Tutte le molecole assorbono. In fase condensata (solidi, soluzione) sono fluorescenti solo molecole con probabilità di transizione radiativa molto elevata: sistemi ad elevata coniugazione. Vantaggio per la sensibilità e la selettività della tecnica.

7 Il fluorimetro Lampada Monocromatore di eccitazione Beam splitter Lente Monocromatore di emissione ecc. Campione PMT segnale PMT riferimento Computer

8 Osservabili: intensità Dipende da: Concentrazione di fluoroforo Efficienza dellassorbimento di radiazione ( ) Efficienza dellemissione radiativa (resa quantica) Ecc. Em.

9 Osservabili: intensità e resa quantica Lintensità di fluorescenza è una misura relativa, perché dipende anche da: Intensità della lampada Efficienza dei monocromatori Banda passante utilizzata Sensibilità del tubo fotomoltiplicatore Ossia dipende dallo strumento con cui è stata determinata Al contrario, lassorbanza è una misura assoluta [A=log(I 0 /I)] la resa quantica è una misura assoluta [ =k r /(k r +k nr )]

10 Filtro interno Ecc. Em. Ecc. Em. Campione diluitoCampione concentrato

11 Assorbanza contro fluorescenza Inoltre: lassorbimento è un processo istantaneo, la fluorescenza no sensibilità molto maggiore allambiente del cromoforo (processi non radiativi) Sensibilità alla dinamica.

12 Osservabili: spettro di emissione ecc. fissa. em. variabile. F in funzione di em..

13 Rilassamento del solvente H2OH2OEtOHDMFc-Hex E h h S0S0 S1S1 S 1 S 0 Ass. Em.

14 Esempi

15 Osservabili: spettro di eccitazione em. fissa. ecc. variabile. F in funzione di ecc.. Se: unico fluoroforo indipendente da ecc. (unico stato eccitato). A<<1 Allora F( ecc. ) A( ecc. ) Altrimenti: separazione dei diversi cromofori

16 Smorzamento della fluorescenza (quenching) Alcune molecole (quenchers), se si trovano in prossimità del fluoroforo eccitato, sono in grado di causare il suo decadimento non radiativo. Misurando lefficienza di smorzamento della fluorescenza si può determinare laccessibilità del fluoroforo al quencher.

17 1 a Esperienza Spettri di assorbimento, emissione ed eccitazione. Intervallo di dipendenza lineare di F da C. Solvatocromismo Processi di associazione

18 Il fluoroforo: PRODAN d = 2.8 Debye d = 10 Debye 6-propionil-2-(N,N-dimetilammino)naftalene (PRODAN) H2OH2OEtOHDMFc-Hex

19 Le ciclodestrine Molecole cicliche formate da unità glucopiranosio (6, 7, 8). Si ottengono per conversione enzimatica dellamido.

20 Complessi di inclusione La struttura 3-D delle ciclodestrine è a tronco di cono, con una cavità apolare. In soluzione acquosa formano complessi di inclusione con molecole idrofobe. Questa proprietà viene utilizzata per modificare le proprietà della molecola ospite: –solubilità –volatilità –tossicità –resistenza alla biodegradazione. I complessi di inclusione hanno inoltre molteplici applicazioni in campo catalitico e separativo. Poiché la ciclodestrina è chirale, i complessi di inclusione sono enantioselettivi.

21 Complessazione ciclodestrina-PRODAN Applicazione: sensori a fluorescenza.


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