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Laboratorio di Microbiologia Aspetti microbiologici nella sepsi: dalla raccolta dei campioni alla corretta interpretazione dei risultati 7 Novembre 2005dott.ssa.

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1 Laboratorio di Microbiologia Aspetti microbiologici nella sepsi: dalla raccolta dei campioni alla corretta interpretazione dei risultati 7 Novembre 2005dott.ssa Claudia Venturelli

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3 Batteriemie e sindromi settiche 842 episodi di batteriemia Gram positivi (n=473=55%) sepsi sepsi severa S.aureus 19,3% 19,8% S.coagulasi Θ 11,2% 6% Enterococchi 5,5% 3,6% Gram negativi (n=407=45%) E.coli 28,1% 22,6% Klebsiella spp 3,4% 5,2% Enterobacter, Citrobacter spp 2,5% 4,4% Ps.aeruginosa 2,7% 5,6% Acinetobacter spp 0,6% 2% Candida ed altri miceti 1,2% 2,4% Brun-Buisson C

4 Gram-negative bacteria account for about 60% of cases, Gram-positive for the remainder The commonest sites of infection are the lungs, abdominal cavity, the urinary tract and primary infections of the blood stream. A microbiological diagnosis is made in about half the cases Nature 420, (19 December 2002); doi: /nature01326 <> The immunopathogenesis of sepsis JONATHAN COHEN

5 Gram-negative septic shock: comprende la metà dei casi totali di sepsi, 115,000 morti/ anno. E il gruppo di batteri che causano il maggior numero di morti per sepsi (30-50%). Gram-positive septic shock: lincremento di casi di shock settico da gram-positivi è dovuto allaumento di polmoniti per batteri gram positivi e alluso di dispositivi intravascolari. La metà dei casi di sepsi è da attribuirsi a gram-positivi.

6 Nosocomial, late onset sepsis occurs in up to 50% of infants of less than 1000gm at birth. The commonest organism isolated is coagulase negative staphylococcus (CoNS). The Cochrane Libary, Issue 4, 2001The Cochrane Libary, Issue 4, The microorganisms most commonly associated with early-onset infection include group B Streptococcus (GBS), Escherichia coli, Haemophilus influenzae, and Listeria monocytogenes Organisms that have been implicated in causing late- onset sepsis syndrome include coagulase-negative staphylococci, Staphylococcus aureus, E coli, Klebsiella, Pseudomonas, Enterobacter, Candida, GBS, Serratia, Acinetobacter, and anaerobes. Neonatal Sepsis June 23, 2004 Author: Linda L Bellig, RN, NNP, Neonatal Nurse Practitioner Program, Medical University of South Carolina, College of Nursing Linda L Bellig, RN, NNP

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11 Policlinico di Modena Nido-Neonatologia

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17 CVC Staphylococcus coaug.neg Aerobic gram negative bacilli

18 Microbial triggers of disease: gram-negative bacteria= endotoxin, formyl peptides, exotoxins, and proteases gram-positive bacteria= exotoxins, superantigens (toxic shock syndrome toxin (TSST), streptococcal pyrogenic exotoxin A (SpeA)), enterotoxins, hemolysins, peptidoglycans, and lipotechoic acid fungal = cell wall material.

19 Patogenesi la sintomatologia clinica è di solito dovuta a prodotti tossici di origine batterica, alla risposta dellospite a questi o ad entrambe. Nei gram-negativi la porzione lipidica A dellendotossina, sita nella membrana lipopolisaccaridica esterna, innesca una catena di reazioni, comprensivi della produzione del tumor- necrosis factor (TNF), interleuchina1 (IL-1) ed attivazione del complemento. I gram-positivi (in particolare Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Stafilococchi) sono privi di lipopolisaccaride, ma sono dotati di altri componenti della parete batterica, come il peptidoglicano, che producono effetti simili.

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27 Quale è il contributo del Laboratorio di Microbiologia nella diagnosi e trattamento della sepsi? Quali indagini microbiologiche richiedere, attualmente, nel caso di sospetta sepsi ? Quando e come raccogliere i campioni?

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30 Diagnosis Appropriate cultures should always be obtained before antimicrobial therapy is initiated. To optimize identification of causative organisms, at least two blood cultures should be obtained with at least one drawn percutaneously and one drawn through each vascular access device, unless the device was recently (<48 hrs) inserted. Cultures of other sites such as urine, cerebrospinal fluid, wounds, respiratory secretions, or other body fluids should be obtained before antibiotic therapy is initiated as the clinical situation dictates. Grade of Recommendation: D Diagnostic studies should be performed promptly to determine the source of the infection and the causative organism. Imaging studies and sampling of likely sources of infection should be performed; however, some patients may be too unstable to warrant certain invasive procedures or transport outside of the ICU. Bedside studies, such as ultrasound, may be useful in these circumstances. Grade of Recommendation: E

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32 Antibiotic Therapy Intravenous antibiotic therapy should be started within the first hour of recognition of severe sepsis, after appropriate cultures have been obtained. Grade of Recommendation: E Initial empirical anti-infective therapy should include one or more drugs that have activity against the likely pathogens (bacterial or fungal) and that penetrate into the presumed source of sepsis. The choice of drugs should be guided by the susceptibility patterns of microorganisms in the community and in the hospital. Grade of Recommendation: D

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34 The antimicrobial regimen should always be reassessed after 48–72 hrs on the basis of microbiological and clinical data with the aim of using a narrow-spectrum antibiotic to prevent the development of resistance, to reduce toxicity, and to reduce costs. Once a causative pathogen is identified, there is no evidence that combination therapy is more effective than monotherapy. The duration of therapy should typically be 7–10 days and guided by clinical response. Grade of Recommendation: E Some experts prefer combination therapy for patients with Pseudomonas infections. Grade of Recommendation: E Most experts would use combination therapy for neutropenic patients with severe sepsis or septic shock. For neutropenic patients, broad- spectrum therapy usually must be continued for the duration of the neutropenia. Grade of Recommendation: E If the presenting clinical syndrome is determined to be due to a non- infectious cause, antimicrobial therapy should be stopped promptly to minimize the development of resistant pathogens and superinfection with other pathogenic organisms. Grade of Recommendation: E

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36 Every patient presenting with severe sepsis should be evaluated for the presence of a focus on infection amenable to source control measures, specifically the drainage of an abscess or local focus on infection, the debridement of infected necrotic tissue, the removal of a potentially infected device, or the definitive control of a source of ongoing microbial contamination. ( See Appendix A in the original guideline document for examples of potential sites needing source control.) Grade of Recommendation: E The selection of optimal source control methods must weigh benefits and risks of the specific intervention. Source control interventions may cause further complications such as bleeding, fistulas, or inadvertent organ injury; in general, the intervention that accomplishes the source control objective with the least physiologic upset should be employed, for example, consideration of percutaneous rather than surgical drainage of an abscess. Grade of Recommendation: E SOURCE OF CONTROL

37 When a focus of infection amenable to source control measures, such as an intra-abdominal abscess, a gastrointestinal perforation, cholangitis, or intestinal ischemia, has been identified as the cause of severe sepsis or septic shock, source control measures should be instituted as soon as possible following initial resuscitation. Grade of Recommendation: E If intravascular access devices are potentially the source of severe sepsis or septic shock, they should be promptly removed after establishing other vascular access. Grade of Recommendation: E

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39 Causes: Sepsis or septic shock may be associated with the direct introduction of microbes into the blood stream via intravenous infusion (eg, IV line, other device-associated infections). There may be perforations, compromise, or rupture of an intra- abdominal or pelvic structure. Bacteremia from bacteruria (urosepsis) may complicate cystitis in compromised hosts. Intrarenal infection (pyelonephritis), renal abscess (intrarenal or extrarenal), acute prostatitis, or prostatic abscess may cause urosepsis in immunocompetent hosts. Sepsis is not a random occurrence and usually is associated with the aforementioned conditions. In addition, sepsis may be caused by overwhelming pneumococcal infection in patients with impaired/absent splenic function. Meningococcemia from a respiratory source also may result in sepsis with or without associated meningitis

40 Le regole generali La raccolta del campione deve avvenire possibilmente prima della terapia antibiotica La raccolta del campione deve essere effettuata nella sede anatomica dellinfezione Prelevare una quantità sufficiente di materiale Evitare ogni contaminazione esogena ed endogena Utilizzare appropriati sistemi di raccolta Contrassegnare il contenitore del paziente, il numero di identificazione, la data e lora del prelievo Consegnare prontamente i campioni al laboratorio Adottare, quando possibile idonee alternative alla consegna immediata Richiedere adeguate notizie cliniche

41 Obiettivo Garantire la sopravvivenza e l isolamento dei microrganismi patogeni, prevenendo la sovracrescita di batteri resistenti con cinetica di crescita piu rapida e garantendo la vitalit à dei microrganismi fastidiosi per riprodurre in- vitro l ecosistema batterico del sito di sospetta infezione, al fine di fornire al clinico risultati attendibili e non inutili o dannosi per il paziente

42 Criticità del prelievo per le indagini microbiologiche Preparazione del paziente Ora del prelievo rispetto allora dellaccettazione Modalità di prelievo Modalita di conservazione Tempo impiegato per il trasporto

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45 BACTEC AUTOMAZIONE COMPLETA Lo strumento è: Lettore in continuo Incubatore Agitatore Tecnologia di lettura La tecnologia di lettura del Sistema Bactec è basata su un metodo fluorimetrico sensibile alla produzione di CO 2 da parte del microrganismo presente. Il Sensore, posto sul fondo del flacone allinterno di una matrice protettiva, contiene composti fluorescenti che reagiscono in presenza di CO 2 prodotta dal microrganismo. Tale matrice consente la diffusione selettiva della CO 2 dal brodo di coltura.

46 Perché lemocoltura puo essere falsamente positiva? I principali fattori sono: -Contaminazione al momento del prelievo per batteri presenti sulla cute del paziente -Contaminazione al momento del prelievo per batteri presenti sulla mani di chi esegue il prelievo -Contaminazione al momento dellinoculo per batteri posti sulla membrana di protezione del flacone -Contaminazione al momento dellinoculo per batteri transitoriamente in circolo, ma non responsabili della sepsi

47 ., Blood culture is the criterion standard for identifying patients with bacteriemia. However, elevated false positive rates are common and are associated with substantial health care costs In the real world of clinical microbiology laboratories, nearly half of all positive blood cultures represent contamination. Complete laboratory workup of contaminant isolates is associated with increased technologist workload and institutional cost. Weinstein M.P., et al. Clin Infect Dis. 1997;24:

48 Indicatore di qualità del prelievo rilevabile nella fase post-analitica: % di Stafilococchi coaug.negativi isolati da emocoltura,

49 Dati della letteratura attestano che gli Stafilococchi coaug.negativi sono responsabili di batteriemie/sepsi significative per il 10% - 30%, variabilmente in relazione alla casistica dellospedale (paziente con accessi vascolari, immunodepressi etc….). In questi microrganismi la meticillino resistenza varia dal 34% al 90%

50 Il problema maggiore del prelievo riguarda la possibilità di contaminazioni esogene del campione con: conseguenti difficoltà interpretative del risultato Trattamenti antibiotici inutili Impossibilità di continuare liter diagnostico di quel stesso prelievo di emocoltura..

51 Perché lemocoltura puo essere falsamente negativa ? I principali fattori sono: - Volume insufficiente -Numero di serie -Timing -Trattamento antibiotico prima del prelievo -Momento del prelievo rispetto al rialzo termico

52 Lefficacia ed il significato clinico dell' emocoltura dipendono da diversi fattori metodologici ed interpretativi, dipendenti soprattutto dalla fase pre-analitica, fra cui principalmente: 1) il volume del campione, 2) il momento del prelievo, 3) l'intervallo ed il numero dei prelievi, 4) l'accuratezza del prelievo 5) le caratteristiche del mezzo di coltura

53 Procedura per la gestione delle emocolture dal paziente al laboratorio Lab di Microbiologia- Rev.05

54 M.Barbieri (Uff.Infezioni Ospedaliere) P.Scannavini (Uff.Infezioni Ospedaliere) A.Berardi, S.Cattani (Nido-Neonatologia) M.Codeluppi (Ch.Trapianti; TIPO) A.Donelli (Unita Trapianti Midollo) G.Guaraldi (Mal.Infettive ) A. Semeraro (Malattie Infettive) M.Luppi (Ematologia) P. Bevini G.Longo (Cure PalliativeHospice) P.Marchegiano (dir.Sanitaria) L.Lucchi (Nefrologia-Dialisi) E.Rubbiani (Nefrologia Intensiva) R. Sabbatini (Oncologia) B:Petocchi (Farmacia) C.Vaccari (Rianimazione) O. Fratti (Rianimazione/TIPO) I. Generali (Rianimazione/TIPO) C.Venturelli (Microbiologia) Referente Gruppo di Lavoro Gruppo di lavoro

55 Suggerimenti per una corretta esecuzione dellesame Effettuare il prelievo il prima possibile e prima dellinizio di eventuali terapie antibiotiche. Nel corso di malattia acuta febbrile (meningite, polmonite batterica) che rende necessaria la terapia empirica non mirata, o in pazienti con malattie infettive (osteomielite, artriti suppurative), per i quali è necessario un intervento chirurgico durgenza, occorre eseguire subito due prelievi in entrambe le braccia.

56 Quando il paziente è in trattamento antibiotico eseguire lemocoltura prima della somministrazione dellantibiotico Il momento del prelievo puo non essere critico nelle batteriemie di tipo continuo (es. Endocardite, brucellosi, febbre tifoide…) perchè sono caratterizzate da crescita e moltiplicazione dei microrganismi direttamente nel corrente circolatorio, dove si ritrovano in carica discretamente alta.

57 Il momento del prelievo risulta fondamentale nei casi di batteriemia intermittente (situazione piufrequente) perchè I batteri entrano nel torrente circolatorio ad intervalli, da un sito di infezione (polmoni, vie genito-urinarie, tratto gastro- intestinale, ascessi, …..): occorre effettuare il prelievo prima del rialzo febbrile in quanto la batteriemia (maggiore concentrazione di batteri nel sangue) puo precedere di oltre unora il rialzo termico E importante studiare la curva termica ed effettuare il prelievo prima di tale rialzo. Se questo non è prevedibile allora prelevare all'inizio del picco. nel caso di endocardite eseguire i prelievi durante il picco ( LG sulla prevenzione, diagnosi, e terapia delledocardite infettiva: Task-force sullendocardite infettiva della Società europea di Cardiologia 2004 )

58 Il volume di sangue posto in coltura rappresenta lelemento piu critico nel rilevamento di una infezione del torrente circolatorio.IL N° di microrganismi presenti in una batteriemia delladulto e frequentemente circa 1 x10 3 UFC/L. Esiste una correlazione diretta fra volume di sangue e positività con un incremento diapprossimativo del 3% di riscontro per ml di sangue inoculato. Si raccomanda linoculo di ml di sangue. Nei neonati e nei bambini lentità della batteriemia è di solito maggiore di quella degli adulti, sebbene possono riscontrarsi livelli ridotti di batteriemia (circa 4x10 3 UFC/L.). Per i neonati si raccomanda un volume di 1-2 ml Il volume di sangue

59 La maggior parte delle batteriemie, ad eccezione di quellericorrenti dei bambinipresentano bassa carica microbica, per cui dovràessere raccolto per ogni set di emocolture un adeguato volume di sangue Da uno studio condotto su pazienti con fungemia, fu dimostrato che la sensibilitàdeltest aumentava del 3%perogni mLdi sangue prelevato in più Attualmente cèla tendenza ad effettuareun minor numero di prelievi, ciascuno costituito da unaquantitàcongrua di sangue, piuttosto che un maggior numero di prelievi, ciascuno costituitoda pochi mL di sangue

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61 Se il rialzo febbrileè preceduto da brividi bisognerebbe eseguire ilprelievo al momento delbrivido. Il momento del prelievo e il Numero di set Il momento ideale per il prelievo è circa 30 minuti dopo la puntata febbrile, poiché in questo periodo sembra essere maggiore la concentrazione di microrganismi in circolo.

62 Emocoltura dovrebbe essere raccolta prima del rialzo termico. TEMPERATURA BATTERIEMIA TEMPO

63 In corso di endocardite infettiva pare non vi sia alcun vantaggio nelleffettuare prelievi in corrispondenza di particolari variazioni della temperatura corporea, essendovi, di fatto, una batteriemia continua anche in presenza di fasi di apiressia. In corso di endocardite infettiva acuta è consigliabile eseguire tre prelievi in una o due ore, nelle prime 24 ore. In corso di endocardite batterica subacuta occorre effettuare 3 prelievi in 24 ore, oppure… … se persiste negatività dopo 48 ore, bisogna eseguire altre 3 emocolture nello spazio di ore

64 Un solo prelievo può non evidenziare una batteriemia intermittente e rende difficile interpretare il significato clinico dellisolamento di certi microrganismi Raramente è giustificato il prelievo di piu di tre set di emocolture, in quanto la sensibilità del metodo non è ulteriormente aumentata. Quando il prelievo viene eseguito da sangue periferico, nel caso di sospetta sepsi e di febbre di origine sconosciuta, i prelievi vanno eseguiti da siti separati

65 Modalità di esecuzione dellemocoltura E' necessario il rigoroso rispetto delle norme di asepsi durante il prelievo: emocolture falsamente positive comportano interpretazioni diagnostiche erronee, con conseguenti terapie inutili. Prima di procedere con manovre per lesecuzione del prelievo è opportuno predisporre il materiale occorrente verificando lintegrità delle confezioni e le relative date di scadenza Arcella pulita Laccio emostatico Cerotto di tela o di carta a seconda del paziente Disinfettante Guanti sterili Agocannula e butterfly per prelievo di diverse dimensioni eventuale doppia via o microgocciolatore Flaconi per emocolture

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67 Effettuare un lavaggio sociale delle mani (secondo le linee guida) Indossare la mascherina Reperire la vena ed effettuare, solo se necessario una tricotomia localizzata applicare il laccio lontano dal punto di inserzione dellago cannula Indossare i guanti sterili Dopo aver identificato la sede da raggiungere si esegue una asepsi della cute per unarea di 5 cm, strofinando in maniera circolare per almeno 2 con cotone imbevuto in una soluzione alcolica di clorexidina gluconata 0,5% (tipo neoxinal alc.0,5%) il sito cutaneo viene poi disinfettato con una soluzione di iodio povidone al 10% o tintura di iodio al 2% con movimento circolare. Evitare di toccare la cute, dopo la disinfezione, nel punto di introduzione dellago. Lasciare asciugare completamente prima di eseguire la venipuntura (1-2 min) avendo laccortezza di non toccare nuovamente col dito la sede da pungere. Evitare per quanto possibile lintroduzione dellagocannula negli arti inferiori o in quelli plegici. In caso di presenza di dispositivi di accessi venosi o centrali il prelievo deve essere eseguito in tale sede e in altra sede periferica. Nel caso in cui si sia intenzionati all inserimento di una nuova ago-cannulla per accesso venoso periferico seguire le indicazioni precedenti già procedurate.

68 Eseguire la venipuntura (laccesso alla vena deve essere distale rispetto al punto definitivo) Fermare lago cannulla o il butterfly con cerotto, raccordarlo in asespi con un raccordo a due vie con camicia per prelievo vacutainer, rimuovere il tappo metallico dal flacone anaerobio dellemocoltura e inserirlo allinterno della camicia. verificare laspirazione del sangue allinterno del flacone per emocoltura e prelevare 10 ml Rimuovere prontamente il flacone dallapposito contenitore di plastica collegare al set di prelievo il flacone aerobio prelevare 10 ml di sangue Rimuovere il secondo flacone dal connettore di prelievo estrarre lago dalla vena e scartare il set in contenitore per rifiuti sanitari a rischio infettivo attaccare su ogni flacone il barcode del nosologico del paziente verticalmente e senza coprire il codice a barre del flacone. Indicare su ogni flacone la tipologia di prelievo (sangue da vena periferica o sangue da catetere) e lora del prelievo Non scrivere assolutamente e non attaccare cerotti, etichette o altri adesivi nella zona del flacone occupata dal codice a barre.

69 non si raccomanda il cambio degli aghi fra la puntura venosa e linoculo dei flaconi in quanto ciocomporta il rischio di punture ed inoltre dagli studi di una meta-analisi la pecentuale di contaminazione sarebbe ridotta in modo moderato.

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71 Tutti i flaconi sono addizionati con CO2. I flaconi anaerobi sono preridotti ed addizionati con CO 2 e N 2. LSodioPolianetolSulfonato è un anticoaugulante che risulta tossico per alcuni tipi di microrganismi: Nei flaconi Bactec la concentrazione di SPS è pari allo 0,025% sufficientemente corrispondente al minimo valore possibile di tossicità per gli eventuali microrganismi presenti. Nel caso di liquidi biologici diversi dal sangue occorre aggiungere FOS o fattore di arricchimento utile per migliorare la crescita di microrganismi esigenti come Neisseria, Haemophilus ecc… Contiene anche fattori che neutralizzano leffetto tossico dellSPS. I flaconi contengono resine che sono le uniche sostanze ad avere proprietà mirata alla neutralizzazione specifica degli antibiotici

72 Tipologia di flaconi da utilizzare BACTEC ·TAPPO BLU (aerobi) ·TAPPO ARANCIONE (anaerobi) ·TAPPO BIANCO (micobatteri / miceti particolari) Volumi raccomandati Adulti aerobio / anaerobio Adeguato da 3 a 10 ml. per flacone Ottimale da 8 a 10 ml per flacone Adulti MicoLytic Adeguato/Ottimale da 3 a 5 ml per flacone Pediatrico Adeguato/Ottimale da 1 a 3 ml. per flacone Luso di volumi più bassi puo prolungare il tempo di rilevamento / isolamento dei microrganismi.

73 Penetrazione del microrganismo attraverso una porta dentrata Formazione di un focolaio sepsigeno, in vicinanza della porta dentrata, ove i microrganismi si moltiplicano (tromboflebitico o linfangitico) Immissione di gittate batteriemiche in circolo Eventuali localizzazioni metastatiche, da cui possono originare altre gittate batteriemiche

74 Invio e Conservazione Dopo il prelievo inviare i flaconi in laboratorio (dalle 8 alle ore 16 dal lunedi al venerdi e dalle 8 alle ore 13 del sabato). Al di fuori di questo orario le emocolture vanno conservate a temperatura ambiente fino al momento dellinvio. Protocolli di prelievo : Protocollo. 1 = Pazienti Neutropenici /Oncologici Protocollo 2 = Unità Intensiva Protocollo 3 = Pazienti Oncologici Protocollo 4 = Malattie Infettive Protocollo 5 = Chirurgia Trapianti Protocollo 6 = Nefrologia Protocollo 7 = Nido-Neonatologia. Protocollo 8 =Tab riepilogo

75 INDICAZIONI ALLA SCELTA DEI VIALS DA EMOCOLTURA BACTEC IN FUNZIONE DELLE VARIE SITUAZIONI EPIDEMIOLOGICHE e/o CLINICHE Protocollo N°1 Pazienti neutropenici e trapiantati midollo N° di venipunture Intervallo di tempo Volume totale di sangue (ml) per singola venipuntura Bactec PLUS AEROBIC 3-10 ML Bactec PLUS ANAEROBI C 3-10 ML Myco- Lytic 3-5 ml ML 1.SOSPETTA SEPSI 2.POLMONITE 2T 1 = 0 T 2 = 10 circa mlXXsu indicazione del medico (2 serie) 1.FEBBRE DI ORIGINE SCONOSCIUTA in paziente con catetere 1.FEBBRE DA SOSPETTA INFEZIONE DA CATETERE INTRAVASCOLARE 2.PAZIENTE CON DIFFICOLTÀ DI ACCESSO PERIFERICO 1 prelievo da catetere + 1prelievo da periferico ( quando possibile ) + 1 prelievo da catetere + 1 prelievo da catetere T 1 = 0 + T 2 = 0 + T 3 = 30 + T 4, = dopo 24 ore se non vi è segnalazione della positività dalla microbiologia mlXX 1.FEBBRE DI ORIGINE SCONOSCIUTA 1 prelievo da periferico + 1 prelievo da periferico + 2 prelievi da periferico T 1 = 0 + T 2 = 60 + T 3,, T 4 = dopo 24 ore con le stesse modalità se non vi è segnalazione della positività dalla microbiologia su indicazione del medico (2 serie)

76 Protocollo N°2N° di venipuntureIntervallo di tempoVolume totale di sangue (ml) per singola venipunt ura Bactec PLUS AEROBIC 3-10 ML Bactec PLUS ANAEROBIC 3-10 ML Myco- Lytic 3-5 ml ML Unità intensiva medica 1.SOSPETTA SEPSI 2.POLMONITE 2 prima della terapia antibiotica T 1 = 0 T 2 = 10 circa ml XX 1.FEBBRE DI ORIGINE SCONOSCIUTA T 1 = 0 T 2 = 60 + T 3, T 4 = dopo 24 ore se non vi è segnalazione della positività dalla microbiologia ml XXsu indicazi one del medico (2 serie) 1.FEBBRE DA SOSPETTA INFEZIONE DA CATETERE INTRAVASCOLARE 1 Periferico + 1 CV T 1 = 0 + T 2 = ml XX

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83 Principali modalità diverse dalla routine Brucellosi, Istoplasmosi, Endocardite. Segnalare il sospetto clinico sulla richiesta in modo che venga prolungata l'incubazione per 3 settimane Consegna al laboratorio I flaconi per lemocoltura devono essere trasportati in laboratorio nel piu breve tempo possibile Se non possono essere consegnati in tempi rapidi devono essere tenuti a T amb.

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86 in caso di: segni o segnali di positività PREPARATO MICROSCOPICO (gram) : comunicazione telefonica e nel referto Semina : Flacone aerobio: su agar sangue, agar cioccolato, mk conkey Flacone anaerobio: su su agar sangue, agar cioccolato, mk conkey, schaedler Identificazione di specie secondo i metodi in uso in laboratorio allestimento prove di sensibilità secondo i metodi in uso in laboratorio

87 segni o segnali di positività EMOCOLTURA in caso di: segni o segnali di positività ANTIBIOGRAMMA DIRETTO Metodi più utilizzati manuali Evidenziare i principali meccanismi di resistenza Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati IDENTIFICAZIONE DIRETTA DEI MICRORGANISMI Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati Attualmente non esistono metodi standardizzati e/o approvati NO

88 Sensibilità delle emocolture Nella sepsi da polmonite da Staphylococcus aureus le emocolture sono spesso falsamente negative (80%) per trattamento antibiotico in atto. Nella sepsi da osteomielite da Staphilococcus aureus le emocolture sono positive nel 50% dei casi Solo il 3-8% delle colture dimostrano la sepsi nei neonati

89 come EMOCOLTURA interpretazione risultati : come identificare i falsi positivi (aspetti clinici) Decorso clinico non tipico Non riscontrata linfezione primaria con lo stesso isolato Assenti i fattori di rischio per batteriemia correlata al microrganismo isolato I segni/sintomi dellinfezione non regrediscono con trattamento antibiotico adeguato rispetto al profilo di sensibilità altro

90 Interpretazione dei risultati (1) Virtualmente qualunque microrganismo, compreso i batteri della normale flora, possono essere causa di infezione del sangue Un risultato negativo non esclude necessariamente una batteriemia: risultati falsamente negativi si hanno quando i patogeni falliscono di crescere Un risultato positivo non necessariamente indica lisolamento del patogeno: risultati falsi-positivi si hanno quando crescono i contaminanti I batteri gram-negativi, gli anaerobi e i miceti dovrebbero essere considerati patogeni, fino a dimostrazione del contrario I maggiori problemi interpretativi di hanno se si isola un microrganismo che normalmente colonizza la flora cutanea:

91 dove: Gli isolati sono considerati lo stesso ceppo se le prove biochimiche e il pattern di sensibilità sono gli stessi tecniche molecolari sarebbero richieste per confermare che isolati multipli sono veramente identicio la % di omologia Raramente ci sono pazienti che hanno vera batteriemia con specie di Stafilococchi coaug.negativi diverse. Nei casi di pazienti con sepsi clinica e a cui non è stata trovata altra eziologia, è appropiato riportare lantibiogramma References: Weinstein MP. Blood culture contamination: Persisting problems and partial progress. J Clin Micro. 2003; 41:

92 Aspetti clinici e laboratoristici proposti per aiutare il microbiologo ed il clinico nella talora difficile interpretazione di un'emocoltura positiva, nel decidere se il microrganismo isolato dal sangue è da considerarsi patogeno o contaminante. lidentificazione del microrganismo; lidentificazione del microrganismo; gli aspetti clinici quali la febbre, la leucocitosi, i risultati di gli aspetti clinici quali la febbre, la leucocitosi, i risultati di indagini radiologiche (disponibili per il clinico ma solitamente indagini radiologiche (disponibili per il clinico ma solitamente non per il microbiologo); non per il microbiologo); il numero di set positivi di emocolture rispetto al numero di il numero di set positivi di emocolture rispetto al numero di set prelevati; set prelevati; il tempo necessario per la rivelazione della crescita dal il tempo necessario per la rivelazione della crescita dal momento del ricevimento del campione in laboratorio; momento del ricevimento del campione in laboratorio; il numero di flaconi positivi allinterno di un unico set di il numero di flaconi positivi allinterno di un unico set di emocolture. emocolture.

93 Interpreting a Positive Blood Culture True Bacteremia: Unlikely Uncertain Likely S. aureus S. pneumoniae Enterobacteriaceae P. aeruginosa C. albicans Corynebacterium spp. Non-anthracis Bacillus spp. Propionibacterium acnes coagulase-negative staphylococci Source: Kim SD, et al: Infect Control Hosp Epidemiol 2000;21:213-7 pre-test probability patient risk factors prosthetic devices clinical evidence post-test probability # positive / # cultures compare antibiograms compare genotypes 12 Steps to Prevent Antimicrobial Resistance: Hospitalized Adults Step 7: Treat infection, not contamination

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95 Altri microrganismi, al contrario, sono responsabili Altri microrganismi, al contrario, sono responsabili di vere batteriemie solo raramente ed includono: di vere batteriemie solo raramente ed includono: Corynebacterium spp. Corynebacterium spp. Bacillus spp. diversi da B. anthracis Bacillus spp. diversi da B. anthracis Propionibacterium acnes Propionibacterium acnes Lisolamento di Stafilococchi coagulasi-negativi, i microrganismi più frequentemente isolati da emocolture, può rappresentare un difficile problema interpretativo. Questi batteri sono spesso contaminanti, ma sono anche stati riconosciuti come agenti eziologici di batteriemie catetere-correlate e batteriemie in pazienti con protesi vascolari o altri tipi di protesi. Una corretta identificazione del microrganismo isolato da unemocoltura può fornire importanti informazioni per linterpretazione.

96 Per gli Stafilococchi coagulasi-negativi il significato clinico non può essere basato solo sulla loro corretta identificazione, e questo vale anche per altri microrganismi. Enterococchi e Streptococchi del gruppo viridans che in recenti studi sono stati considerati patogeni nel 78% e 38% delle volte rispettivamente. Clostridium perfrigens che spesso (77%) è stato considerato un contaminante, mentre Clostridium spp. diversi da C. perfrigens molto spesso (80%) sono stati considerati come patogeni. Weinstein M.P. et al. CID. 1997; 24: Una corretta identificazione del microrganismo isolato da unemocoltura può fornire importanti informazioni per linterpretazione.

97 SCN: storia 1958: prime osservazioni di sepsi causate da SCN (Smith) 1962: Pereira ipotizza il ruolo patogeno di S. saprophyticus nelle infezioni delle vie urinarie 1965: Wilson e Stuart segnalano lisolamento di SCN da infezioni di ferita nel 4,4% dei casi (1200 campioni, 53 colture pure) 1965: Pulverer tenta di pubblicare il primo lavoro relativo alle endocarditi causate da SCN. Il lavoro verrà accettata solo nel : prima descrizione della colonizzazione di shunt ventricolo-atriali da SCN (Holt) anni 80: SCN prima causa di endocarditi su valvola protesica anni 1990-oggi: SCN prima causa di sepsi nosocomiali in reparti critici. Prime descrizioni di cassetti genici di resistenza. Evidenza di ceppi con diminuita suscettibilità ai glicopeptidi. E.C., 2004

98 SCN: studi di patogenicità Gli SCN causano infezioni per la loro capacità di aderire a biomateriali. La patogenicità di SCN è stata valutata nel modello animale, valutando la capacità di produrre ascessi dopo cateterizzazione con dispositivi infettati S. schleiferi è risultato in grado di causare infezione in tempi brevissimi, altri studi successivamente hanno dimostrato che questo microrganismo può causare infezione anche indipendentemente dal biomateriale S. epidermidis e S. lugdunensis causano ascessi di grado severo o di media gravità; il primo può causare infezione indipendentemente dal biomateriale S. hominis, S. warneri e S. capitis sembrano essere dotati di minori patogenicità; S. epidermidis e S. capitis sono quelli in grado di colonizzare per maggior tempo la cute sana (oltre due mesi) Alcuni SCN sono correlati a peculiari problemi di resistenza agli antibiotici: il 20% dei ceppi di S. haemolyticus, ad esempio, presenta una ridotta sensibilità alla teicoplanina E.C., 2004

99 SCN: meccanismi di patogenicità Più frequentemente infezioni associate a biomateriali Adesina polisaccaridica/capsulare (PS/A): è un polimero di galattosio e arabinosio, 1:1). Sintesi assai precoce (entro 15 minuti dopo il contatto con il biomateriale) PS/A altamente immunogena MA in infezioni sperimentali NO risposta immune (probabilmente per gli effetti immunomodulanti degli acidi teicoici) Altre adesine: matrice proteica, tardive Adesività mediata da fibronectina, fibrinogeno, collagene, vitronectina. Il meccanismo patogenetico non è dissimile rispetto a SA, con produzione finale di ESS (extracellular slime substance) E.C., 2004

100 SCN: significato clinico intrinseco SCN per i quali è stato riconosciuto un possibile ruolo patogeno: S. epidermidis, S. capitis, S. sacchorolyticus, S. warneri, S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. auricolaris, S. cohnii, S. saprophyticus, S. xylosus, S. simulans, S. schleiferi, S. pasteuri, S. caprae. Una significatività clinica sembra correlarsi agli isolamenti di: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. lugdunensis, S. simulans, S. schleiferi, S. saprophyticus (+++ distretto urinario) E.C., 2004

101 Interpretazione dei risultati (4) il numero di set di emocolture puo altresì essere utilizzato per interpretare il significato di un emocoltura positiva: I contaminanti spesso crescono in 1solo set su 2/3 set prelevati: il numero dei set positivi/set eseguiti è predittivo del significato clinico. (Weinsten )

102 Nei pazienti con endocardite o altre infezioni ematiche tutte le emocolture o la maggioranza di queste risultano positive. I pazienti le cui emocolture sviluppano contaminanti solitamente hanno una singola emocoltura positiva (quando 2 o più emocolture sono eseguite). Se 1 singola emocoltura viene eseguita quanto detto precedentemente non ha più senso. Eccellente ragione per cui almeno 2 set di emocolture devono essere raccomandati come pratica standard. Eseguire > 1 set di emocolture aiuta nellinterpretazione del significato clinico di unemocoltura in virtù del seguente calcolo: in unistituzione con % di contaminazione baseline delle emocolture del 3%, la probabilità di ritrovare lo stesso microrganismo (come contaminante) in 2 set di emocolture dello stesso paziente è < 1 su 1000 (0.03 x 0.03 = ). N° di set di emocolture positive valutato in funzione del N° di set di emocolture eseguite

103 Altri studi recentemente pubblicati (Mirrett J.Clin.microbiol.2001) dimostrano che il numero di flaconi positivi non è uninformazione utile per distinguere un microrganismo da patogeno a contaminante

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107 I Dati pubblicati, almeno per gli Stafilococchi coagulasi- negativi (CoNS), dimostrano che questa tecnica non è utile clinicamente. CoNS clinicamente significativi possono crescere più spesso in flaconi multipli allinterno di un set di emocolture, mentre i contaminanti più spesso crescono in un solo flacone del set, tuttavia il grado di sovrapposizione è tale che per una data coltura questa informazione non è in grado di predirne in modo attendibile il significato clinico. Valutazione del numero di flaconi positivi allinterno di un set di emocolture

108 Algoritmo di Weinstein Weinstein MP et al. J Clin Microbiol 2003, 41: solo campione positivo su 1 inviato: significato indeterminato (se SCN) (il reparto deve contattare il laboratorio per ulteriori approfondimenti diagnostici) 2-3 inviati probabile contaminante (se SCN) (no identificazione di specie, no antibiogramma)

109 Weinstein MP et al. J Clin Microbiol 2003, 41: o più campioni positivi per un probabile contaminante diverso da CoNS entro 48 ore: identificazione a livello di specie: stessa specie - Test di sensibilità (AST) specie diverse - probabili contaminanti - No AST 2 o più campioni positivi per CoNS Identificazione a livello di specie AST Isolati con = profilo biochimico e = test di sensibilità Probabile siano identici (conferma solo con tipizzazione molecolare), aumenta il loro probabile significato clinico Identificazione e test di sensibilità riportato al clinico Isolati con profilo biochimico o test di sensibilità Probabili contaminanti Riportata al clinico lidentificazione di 2 diversi CoNS, No AST

110 Tokars J.I. - CDCs Atlanta. Predictive value of blood cultures positive for coagulase-negative staphylococcci: implication for patient care and health care quality assurance. CID 2004; 39: Coagulase negative staphylococci (CoNS) are the pathogens most commonly reported to cause central vascular line-associated bloodstream infections, accounting for 38% of such infections reported to the CDCs National Nosocomial Infections Surveillance system during (CDC unpublished data). However, CoNS are also common skin commensals that frequently contaminate blood cultures. A mathematical model to assist in the interpretation of blood culture results is presented. Although this model could be used for any organism or patient population, input parameter values were selected to apply to CoNS-positive blood cultures in patients with a central vascular line in place. Patients did not have an infection with a known source (e.g., endocarditis and surgical wound infection) other than a central vascular line. These results represent the first systematic calculation for various number of positive culture results among samples obtained either by vein or through a central vascular line.

111 Sensitivity and positive predictive value (PPV) of blood culture positive for coagulase-negative staphylococci among patients with central vascular lines (CVLs) in place N° of culture performed N° of positive culture results All culture of sample obtained by vein Sensitivity % a PPV PPV by no. of culture of samples obtained by CVC % or … … … … NOTE. Initial parameter values (bacteriemia rate, 3%; contamination rate, 2%; detection rate, 80%; catheter colonizationn rate, 2%; risk ratio, 1; see Parameter Definitions and Values) were used for all calculation. a : Equivalent to the percentage of true cases of bacteremia that will show the number of positive culture results among the number of cultures performed. Source: Tokars J.I. - CDCs Atlanta. CID 2004; 39:333-41

112 Tokars J.I. - CDCs Atlanta. Predictive value of blood cultures positive for coagulase-negative staphylococcci: implication for patient care and health care quality assurance. CID 2004; 39: These results suggest the following rules for interpreting cultures positive fo CoNS: for 1 positive result of 1 culture performed, the result is indeterminate; for 1 positive result of 2 cultures performed, CoNS bacteremia is unlikely; if 2 of 2 or 2-3 of 3 culture results are positive, CoNS bacteremia is very likely if at most 1 culture sample was obtained through a central vascular line. If local rates of contamination and bacteremia are available, estimates of predictive value could be routinely provided along with blood culture results, thus assisting in both clinical decision-making and hospital quality assurance.

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114 Necessaria premessa: la crescita dei patogeni, che normalmente sono presenti in grandi quantità, dovrebbe essere rivelata in tempi più brevi rispetto ai contaminanti, che solitamente sono presenti in quantità più piccole. Tuttavia, pur avendo questo concetto una certa validità, il grado di sovrapposizione del tempo di rilevazione tra i veri patogeni ed i contaminanti è tale che questa variabile non può essere utilizzata come fattore predittivo di una coltura vera-positiva. Inoltre, con il largo utilizzo dei sistemi colturali automatici a monitoraggio continuo dei flaconi di emocolture e la concomitante riduzione dei tempi di rivelazione della crescita, le differenze di tempo tra la rivelazione dei veri patogeni e dei contaminanti risultano talvolta poco significative. Il tempo necessario perchè lemocoltura venga rilevata come positiva

115 EMOCOLTURA giudizio di positività giorni di positività e positività multiple 1 giorno 2 giorni 3 giorni 4 o più giorni Il Tempo di positivizzazione puo essere inversamente proporzionale al ruolo patogeno del microrganismo Più di un flacone positivo > probabilità di vera batteriemia

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117 Interpretazione dei risultati (2) In caso di isolamento dello stesso stipite di Stafilococchi coaugulasi negativi, Corinebatteri, Streptococcus viridans, Micrococcus spp, Bacillus spp.si propone il seguente algoritmo Caso 1 1 sangue da periferico POS *possibile patogeno, valutare la clinica e se necessario eseguire ulteriori prelievi nelle 24 ore 1 sangue da periferico POS Caso 2 1 sangue da periferico POS Probabile contaminante valutare la clinica e se necessario eseguire ulteriori prelievi nelle 24 ore 1 sangue da periferico NEG

118 Caso 3 1 sangue da catetere POS *Significativo, patogeno 1 sangue da periferico POS Se lintervallo tempo di positivizzazione dei 2 flaconi è > 120 min. è altamente probabile infezione correlata a catetere. Caso 4 1 sangue da catetere NEG *Probabile contaminante/colonizzante, valutare la clinica e il rischio per il paziente; se necessario ripetere I prelievi nelle 24 ore. 1 sangue da periferico POS

119 N.B. Per interpretare correttamente il risultato, è fondamentale poter risalire esattamente alla tipologia di prelievo e allora del prelievo(da catetere o da vena periferica), mediante la sigla scritta sul flacone, al momento del inoculo in reparto.

120 Interpretazione dei risultati (5) Casistica altamente suggestiva per considerare un CONS contaminante: 1 emocoltura pos seguita da emocolture neg 1 set pos su 2 ottenute simultaneamente 2 set pos, ma separati da un intervallo di tempo con piu di un set negativo solo un flacone pos (aerobio o anaerobio) di un set

121 Interpretazione dei risultati (6) Possibili Criteri di laboratorio per assistere il clinico nell assegnare un significato di patogeno o contaminante ad un microrganismo che appartiene alla flora cutanea. 1) CNS, P.acnes, Corynebacterium spp. o Bacillus spp. isoalti da 1 di parecchie colture 2) crescita di piu di un microrganismo da parecchie colture 3)isolamento da emocolture di un microrganismo che differisce dallorganismo causa dellinfezione nel sito primario dellinfezione stessa. 4)tempo di positivizzazione

122 interpretazione risultati : falsi negativi Terapia antimicrobica (60% dei negativi) Uremia Principali cause legate a microrganismi cosidetti difficili Batteri del gruppo HACEK Abiotrophia :Nutritionally variant streptococci Miceti Nocardia spp Bartonella spp Altri batteri a lento o lentissimo sviluppo

123 Principali cause legate a microrganismi coltivabili solo conmetodiche specifiche e quindi da prelevare ed inviare al laboratorio con modalità diverse: Micobatteri Leptospira spp Legionella spp. Borellia spp Principali cause legate a microrganismi non coltivabili nei comuni terreni da emocoltura e pertanto evidenziabili mediante prove sierologiche, colture cellulari o, se disponibili, tecniche molecolari Chlamydia spp. Coxiella burneti (febbre Q) Altre Rickettsie Tropherina whippleri (Whipple disease bacillus

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125 diagnosi di laboratorio delle micosi invasive : isolamento da sangue Isolamento da sangue diagnosi di micosi invasiva 58% lisi centrifugazione/pcr Scarsa sensibilità ( 50%) per i lieviti 50-58%automatizzati Scarsissima sensibilità ( 0%) per Aspergillus

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128 Criteri per la diagnosi di endocardite infettiva (3) (Duke criteria di Durak et al., - modificati da Li et al., 2000) 1)Emocolture positive per endocardite infettiva a)Microrganismi tipici di E.I. isolati da 2 emocolture separate (streptococchi viridanti, Str. bovis, Staph. aureus, HACEK group, enterococchi acquisiti in comunità in assenza di un focolaio infettivo primario). b)Isolamento ripetuto di microrganismi potenzialmente responsabili di E.I.: –almeno 2 emocolture prelevate a più di 12 ore di distanza; –3 emocolture o la maggioranza di 4 o più emocolture prelevate in un intervallo di tempo di almeno 1 ora tra la prima e lultima; c)per Coxiella burnetii un titolo di anticorpi IgG > 1/800. oppure oppure CRITERI CLINICI MAGGIORI

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130 Criteri per la diagnosi di endocardite infettiva (5) (Duke criteria di Durak et al., - modificati da Li et al., 2000) 1)Fattori cardiaci predisponenti o tossicodipendenza e.v. 2)Febbre 38°C. 3)Fenomeni vascolari (emboli arteriosi, infarti polmonari settici, aneurisma micotico, emorragia cerebrale o congiuntivale, lesioni di Janeway). 4)Fenomeni immunologici (glomerulonefrite, noduli di Osler, macchie di Roth, fattore reumatoide). 5)Evidenza microbologica (emocolture positive* che non soddisfano i criteri maggiori, evidenza sierologica di uninfezione attiva dovuta a microrganismi potenzialmente responsabili di E.I.). *Escluso singole emocolture positive per stafilococchi coagulasi-negativi o per microrganismi che non causano E.I. CRITERI CLINICI MINORI

131 Endocarditi a emocoltura negativa (1) CAUSE PRINCIPALI: uso terapia antibiotica durante o prima dei prelievi colturali presenza di microrganismi che non crescono nei terreni convenzionali INOLTRE: infezioni che durano da oltre tre mesi uremia endocarditi murali o da pace-maker endocarditi non infettive diagnosi errata di E.I.

132 Endocarditi infettive Infezioni setticemiche a focolaio sepsigeno endocardico Agenti eziologici : schizomiceti, miceti, rickettsie, clamidie Streptococcus viridans ( ~ 40%) Streptococcus faecalis (~ 25-30%) Staphylococcus aureus o epidermidis (~ 20%) Batteri gram-negativi Candida spp. C. burneti, R. prowazeki ecc., ecc. Endocarditi a emocoltura negativa (10%)

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134 Eziologia delle E.I. Valvola nativaValvola protesica (%)(%) Streptococcus spp Staph. aureus Staf. coagulasi-negativo Enterococcus spp Batteri gram-negativi HACEK Miceti (New Engl J Med 2001; 345: )

135 Unusual causes of bacterial endocarditis Gram-positive bacilli Gram-negative bacilli Listeria Legionella Corynebacterium Coxiella Bacillus Brucella Erysipelothrix Neisseria Lactobacillus Branhamella Clostridium Vibrio Propionibacteria Veillonella Rothia Bartonella Arachnia Other Actinomyces Chlamydia Mycobacteria Mycoplasma Nocardia

136 Diagnostica biomolecolare (PCR) Lamplificazione genica eseguita con PCR a largo spettro (es.: 16S rRNA gene), seguita dal sequenziamento diretto dellamplicone, è una tecnica che ha dato buoni risultati se applicata alle valvole rimosse chirurgicamente di pz. con E.I. Non è ancora chiaro se essa può essere applicata, negli stadi iniziali della malattia, sulle cellule mononucleate del sangue periferico o sul siero di pazienti con emocolture negative.

137 Criteri di duke per la diagnosi di E.B. La diagnosi è definita se vi sono 2 criteri maggiori o 1 criterio maggiore e 3 minori o 5 criteri minori. CRITERI MAGGIORI 1)Emocolture positive ( 2/2) 2)Interessamento endocardico (nuovo soffio o ecocardiogramma positivo) CRITERI MINORI 1)Fattori predisponenti cardiaci o tossicodipendenza 2)Febbre 3)Fenomeni immunologici (glomerulonefrite, Osler, Roth spots, fattore reumatoide) 4)Ecocardiogramma compatibile ma non diagnostico 5)Fenomeni vascolari: emboli, petecchie, ecc. 6)Emocolture positive ma non diagnostiche o evidenza sierologica di infezione batterica

138 13 % delle infezioni ospedaliere 20 % di tutte le sepsi casi anno negli USA Sepsi da CVC

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154 Differential Time to Positivity Of Hub vs Peripheral Blood Culture StudySetting N° patients Blood culture system Golden standard Reynders, 2001 Bussy, 2001 Seifert, 2003 Gaur, 2003 Blot, 1999 Blot, 1998 Med-surg. ICU Cancer Centres Hemato-onco dept. Pediatric Cancer Centre ICU, Cancer Centre Cancer Center BacT/Alert Bactec Plus A/Ana Vital Quantitative KT (Sherertz) Paired Isolator > 5H/P Quantitative KT (Brun-Buisson) Paired Isolator > 5H/P

155 Differential Time to Positivity Of Hub vs Peripheral Blood Culture StudySetting Significant DTP Sensitivity % Specificity % Reynders, 2001 Bussy, 2001 Seifert, 2003 Gaur, 2003 Blot, 1999 Blot, 1998 Med-surg. ICU Cancer Centres Hemato-onco dept. Pediatric Cancer Centre ICU, Cancer Centre Cancer Center No Yes (3 ore) Yes (2 ore)

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160 Conclusione: Sepsi correlata catetere la diagnosi si avvale di: isolamento dello stesso microrganismo dal sangue da vena periferica e da catetere differenza del tempo di positivizzazione tra Sg e SgCV > 120 min. se le emocolture sono state eseguite alla stessa ora di prelievo. isolamento dello stesso microrganismo da emocoltura e da coltura semi-quantitativa o quantitativa del catetere.

161 Unresolved Question Difference in Time to Positivity (DTP) in paired blood cultures: short-term percutaneous catheter? patients with prior antibiotic therapy? Discrimination of contaminant from infecting CoNS serodiagnosis (lipid S, other antigens ?) biofilm determinants ?? molecular typing ? Frequency of polyclonal infection ?

162 Use of collection method that increase the chances for sterility: Obtaining blood via venipuncture rather than from an intravascular catheter Using a two-needle rather than a single-needle technique Some antiseptic preparations may be more efficacious than other in reducing contamination rates. Trained phlebotomists or blood culture teams can reduce contamination rates in individual institutions REDUCING THE NUMBER OF CONTAMINATED BLOOD CULTURES Although is not possible to achieve contamination rates of zero or even close to zero, there are potential means by which contamination can be reduced

163 TABLE 1. Clinical significance of results of concurrent intravascular catheter-drawn and direct venipuncture blood cultures Clinical significance of blood culture results No. of samples (%) Catheter- drawn Direct venipuncture True bloodstream infection203 (14.4)193 (13.7) Contamination54 (3.8) *26 (1.8) * Indeterminate23 (1.6)12 (0.9) Negative1,128 (80.1)1,177 (83.6) Total1,408 (100) Everts R.J., E.N. Vinson, P. O. Adholla, and L.b. Reller.g Contamination of Catheter-Drawn Blood Cultures JCM : * P = 0.001

164 Norberg A., Christopher N.C., Ramundo M.L., Bower J.R, Berman S.A. Contamination rates of blood culture obtained by dedicated phlebotomy vs intravenous catheter JAMA 2003;289: Objective: to compare contamination rates in blood culture specimens obtained from separated sites vs through newly inserted intravenous catheters among patients age 18 years or younger Contaminants Coagulase-negative staphylococci Streptococcus viridans Corynebacterium species Micrococcus species Bacillus species Propionibacterium acnes Neisseria species Others Total No. of Organisms Catheter-drawn*Direct venipuncture** No. of organisms (% of Total contaminated specimens) 140 (73) 57 (30) 13 (7) 3 (1.6) 4 (2) 3 (1.6) 10 (5) (67) 8 (14) 7 (12) 5 (8) 3 (5) (8) 65 Conclusion: The false positive blood culture rate decreased from 9.1% to 2.8% (P<0.001)

165 Contamination rates in percent of blood cultures drawn by phlebotomy team vs. nonphlebotomy team Facilities in which most cultures were drawn by a team of phlebotomists Facilities in which most cultures were drawn by nonphlebotomists Weinbaum, et al. (Unit A)1.2%8.4% Weinbaum, et al. (Unit B)1.0%4.8% Schifman, et al.2.2%3.9% Weinbaum FI., Lavie S., Danek M., Sixsmith D., Hainrich G., Mills S. Doing it right the first time. Quality improvement and the contaminant blood culture. J Clin Microbiol. 1997;35(9): Schifman R., Strand C., Meier F., Hawanitz P. Blood culture contamination. Arch Pathol Lab Med. 1998; 122:

166 Criticità del prelievo per le indagini microbiologiche Preparazione del paziente Ora del prelievo rispetto allora dellaccettazione Modalità di prelievo Modalita di conservazione Tempo impiegato per il trasporto

167 Attualmente controllare sistematicamente questo processo non è possibile: Monitoraggio dellora del prelievo ( limite della compilazione manuale delle richieste ) Identificazione, nella fase post-analitica, di indicatori di qualità del prelievo

168 Nel 90% dei campioni è stata segnalata la data del prelievo Nel 40% dei campioni è stata segnalata lora del prelievo

169 Nel 12,2% dei campioni per coprocoltura è nota lora /data del prelievo Nel 34,1% dei campioni di ricoverati è segnalata lora/data del prelievo per coprocoltura

170 Indicatore di qualità del prelievo rilevabile nella fase post-analitica: % di urinocolture con flora da probabile contaminazione

171 La raccolta và eseguita seguendo le corrette modalità di prelievo indicate dal Manuale dei Laboratori 2) Devono essere processate entro 2 ore dal prelievo 3) La conservazione è prevista a 4-8 ° per un massimo di ore, oppure 4) la raccolta và eseguita in appositi contenitori con stabilizzante (acido borico o altri sistemi disponibili in commercio) fino a 48 ore a T.amb 4) Le urine raccolte con sacchetto, nelletà pediatrica, sono attendibili solo se il risultato è negativo

172 Perché è importante raccogliere lurina del primo mattino ? Perché si ha la massima concentrazione di batteri. Lurinocoltura è unesame quali-quantitativo e lespressione della carica batterica è inversamente proporzionale al grado didratazione. Basse cariche batteriche possono comportare un risultato falsamente negativo

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175 Urina dopo T >2 ore circa del prelievo a T amb. Urina appena raccolta Urina dopo T > 4 ore dal prelievo a T amb. Urina dopoT > 6 ore dal prelievo a T amb

176 (Very) major error ……una urinocoltura negativa …… viene refertata Positiva Con conseguente: Identificazione ed antibiogramma eseguiti inutilmente su tracce di un microrganismo colonizzante Possibile trattamento antibiotico non necessario

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179 Lisolamento di un microrganismo da un emocoltura di un neonato con sintomi clinici di infezione costituisce la comune definizione di sepsi. In caso di Stafilococchi coaug.neg., molti studi recenti richiedono lisolamento dello stesso microrganismo da due emocolture o da una singola emocoltura con altre evidenze di laboratorio di sepsi, come un elevato valore di PCR. Lo schema di classificazione adottato per pazienti pediatrici ed adulti, con le quattro categorie di sepsi, non puo essere adottato per i neonati. Lo sviluppo di neonatal sepsis scale richiede una piu rigorosa definizione di sepsi clinica nei neonati con una miglior correlazione con loutcome e una piu consistente interpretazione degli studi di ricerca clinici ed epidemiologici.

180 Infezione delle vie urinarie: è generalmente definita come la crescita di almeno 100 CFU /ml da un campione ottenuto da puntura sovrapubica o di almeno CFU/ml da un prelievo mediante cateterizzazione sterile. Conte inferiori possono essere indicative di infezione in bambini pre- termine, in particolare se viene isolato Candida spp. O un gram-negativo. Lurinocoltura non è indicata nella valutazione delle EONS dal momento che lurina è sterile nelle prime ore di vita. Tuttavia, lurinocoltura dovrebbe essere ottenuta in tutte le valutazioni di sepsi oltre 3 gg di vita, dal momento che la manifestazione clinica di UTI e sepsi sono simili.

181 Diagnosi di meningite: Lisolamento di un microrganismo da liquor in un bambino pretermine è generalmente considerato evidenza di meningite. La diagnosi di meningite è problematica nei bambini VLBW dal momento che il prelievo lombare viene spesso eseguito dopo la somministrazione di antibiotici. Inoltre dal momento che la meningite puo decorrere senza setticemia e che le emocolture possono essere falsamente negative, questo puo sottostimare il trattamento per meningite nei VLBW. Diagnosi di polmonite: La polmonite rimane la piu difficile infezione da diagnosticare nei bambini pre-termine. I microrganismi coltivati dal tubo endotracheale spesso rappresentano colonizzanti piuttosto che responsabili di polmonite. La coltura quantitativa puo essere daiuto.

182 Il gold standard per la diagnosi di sepsi neonatale rimangono le emocolture, sebbene in molti casi siano negative. In uno studio condotto nel 1999 sulle autopsie di ELBW bambini, con infezione considerata la prima causa di decesso, nel 61% dei neonati le emocolture eseguite prime della morte erano negative. Lantibiotico somministrato alla madre nella maggior parte dei parti pre- termine puo sopprimere la crescita batterica dalle emocolture. Risultati falsi negativi in neonati con sospetta sepsi, si possono avere a causa di insufficiente inoculo di sangue. In uno studio prospettico di circa 300 emocolture, il volume prelevato era meno di 0,5 ml di sangue. Le difficoltà tecniche di prelievo nei bambini pretermine decresce la sensibilità dellemocoltura per la diagnosi di sepsi.

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184 Non culture microbiological method for predicting bloodstream infection Antigen detection : usato in passato su liquor e urine per la presenza di GBS, ha una sensibilità che và dal 72 al 89 % per il liquor e debolmente piu bassa per le urine. Diagnostica molecolare: la determinazione di batteri nel sangue avviene mediante PCR del gene 16S rRNA, presente nei batteri ma assente nelluomo. Il rilevamento di meno di 10 microrganismi per ml da sangue intero è stato riportato e ricerche per migliorare la sensibilità del metodo e per automatizzare il processo sono in corso. Studio di Jordan et coll. 548 campioni appaiati di sangue/emocolture da bambini in NICU con sospetta sepsi: di 25 prelievi con emocolture positive, 24 erano positive con PCR con risultato disponibile in 9 ore con possibilità di discriminare tra gram positivi e gram negativi. Sensibilità, specificità, VPP, VPN, = 96, 99,4, 88,9, 99,8 %

185 La determinazione della fungemia mediante PCR è unimportante area di studio: confrontata con le emocolture la PCR ha una sensibilità e specificità del 100% e 98%. Studio Jordan et al: 9 positivi sia con PCR che con emocoltura, 44 negativi con entrambi i metodi, 3 positivi con panfungal e negativi alle emocolture con evidenza di infezione invasiva da miceti (segni di sepsi ed in 2 casi candiduria, 1 caso con peritonite da Candida). Tra le nuove metodiche vi è la real time PCR quantitativa. Che necessita di trials clinici per stabilirne lutilità nel predire la presenza o assenza di infezione disseminata da miceti o da batteri.

186 Endotoxin Activity Assay (EAA) approved FDA i risultati sono disponibili in 1-2 ore Utilità clinica è oggetto di studi alto V.P.N. (>98%) da studio multicentrico-internazionale di 529 pz. dellICU (MEDIC study)

187 Le colture microbiologiche rappresentano il gold- standard, ma presentano limiti dovuti alla sensibilità, ai tempi per la disponibilità dei risultati e alla contaminazione dei campioni. inoltre mentre esistono dei criteri interpretativi per valutare i risultati positivi,non esistono tuttora criteri standardizzati per valutare le colture con esito negativo, in caso di elevato sospetto di infezione. LEAA potrebbe rappresentare un nuovo test diagnostico nellalgoritmo decisionale del clinico nelliniziale sospetto di sepsi da gram-negativi.

188 Vantaggi: rilevare la presenza del prodotto del microrganismo patogeno anche quando il microrganismo non è in circolo per azione dellantibiotico o per traslocazione dallintestino nei pazienti a rischio. Ci sono molte evidenze che lendotossina è il principale iniziatore nella patogenesi della sepsi, con possibilità di diagnosi precoce. Svantaggi: dosaggio limitato ai gram negativi. La presenza in circolo dellendotossina in circolo puo avvenire per cause diverse dallinfezione.

189 La molecola dellendotossina complessata ad una proteina carrier del siero, nota come lipopolysaccharide-binding protein (LPS), si lega alle cellule dellospite attraverso un specifico recettore CD14. Il legame con CD14 e lattivazione di un recettore noto come toll- likereceptor 4 (tlr4) risulta nellattivazione cellulare, con la sintesi e il rilascio di mediatori che producono la sindrome clinica della sepsi. Il saggio è stato sviluppato per dosare lendotossina da sangue intero; si basa sulla formazione dellimmuno-complesso endotossina- IgM che viene completamente opsonizzato e successivamente sottoposto allattività di burst respiratoria dei neutrofili. Questo processo è incrementato dalla sostituzione del neutrofilo con zymosan e viene misurato il rilascio di acido ipocloro mediante le sua reazione con luminol e con conseguente chemioluminescenza nella reazione con il buffer. Lintensità del respiratory burst è correlata con la bio-attività dellendotossina mediante una curva iperbolica di risposta. I valori di cut-off di EA sono espressi, in associazione con il consensus conference della definizione di sepsi, in 0,60 pos.

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191 Marcatori bioumorali e rischio di evoluzione IL-6 TNF-α Procalcitonina Adrenomedullina CD4 solubile Proteina 1α macrofagica Fosfolipasi A2 extracellulare Le manifestazioni cliniche della SIRS sono proteiformi, gli aspetti biochimici possono essere più consistenti

192 Polimorfismo genetico delle molecole infiammatorie IL-1α e IL-1β IL-6 IL-10 IFN-γ TNF-α TGF-β Lallele TNF2, meno comune, è associato ad incrementato rischio di morte nelle popolazioni settiche Mira JP / Wax RS / Vincent JL

193 Abstract: Purpose of review: The purpose of this review is to indicate recent developments in biomarkers of sepsis and to evaluate their impact on clinical use. According to the 'surviving sepsis campaign,' diagnosis of sepsis and infection is urgent; early and specific treatment is most effective to reduce complications and to decrease mortality. Recent findings: A variety of biomarkers of sepsis is presently available. The diagnostic spectrum of the various markers, however, is different. Some primarily indicate severity of inflammation (e.g. interleukin-6), others respond to infection, but do not indicate the host response well (endotoxin, lipoprotein binding protein, triggering receptor on myeloid cells). There are new markers with limited clinical experience, for example triggering receptor on myeloid cells or mid-pro atrial natriuretic peptide (Seristra, Brahms AG, Hennigsdorf, Germany). Procalcitonin is a well-established biomarker of sepsis that fulfills several criteria of clinical needs: it responds both to infection and severity of inflammation and thus has an impact on therapy. Recent studies indicate that antibiotic treatment can also be guided by procalcitonin. Further indications, including diagnosis of invasive bacterial infections and diagnosis of sepsis in neonates and children have been reported recently. Biomarkers of sepsis: clinically useful? Current Opinion in Critical Care. 11(5): , October 2005.Meisner, Michael

194 Summary: Recent data and cumulative analyses indicate that biomarkers of sepsis improve diagnosis of sepsis. However, only a few markers have impact on therapy and fulfill the clinical requirements. Procalcitonin is a well-established marker, indicating infection, sepsis, and progression to the more severe stages of the disease. Today, this biomarker should be in the diagnostic portfolio of an intensive care unit or emergency ward Lippincott Williams & Wilkins, Inc.

195 Nuovi scenari nella diagnosi microbiologica di sepsi

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200 Rapid Diagnosis of Bacterial Sepsis with PCR Amplification and Microarray Hybridization in 16S rRNA Gene SHIQIANG SHANG, GUOXIAN CHEN, YIDONG WU, LIZHONG DU and ZHENGYAN ZHAO Lab Center [S.S., Y.W.], Department of Neonatology [L.D., Z.Z.], Affiliated Children's Hospital of Medical College, Zhejiang University, Hangzhou , P.R. China, Department of Burn Injuries [G.C.], The Second Affiliated Hospital of Medical College, Zhejiang University, Hangzhou , P.R. China

201 Lab-on-Chip enables rapid bacterial diagnosis. September 29, Designed for DNA-based detection of sepsis-causing bacteria, lab-on-chip is based on In-Check platform with diagnostic panel from Mobidiag. In-Check has integrated low-density microarray and amplifies clinically relevant DNA samples by PCR analysis. Microreactors buried in MEMS chip carry mixture of sample and reagents, while on-chip heating elements perform temperature cycling. Chip interfaces to thermal control system that actuates, monitors, and adjusts parameters of reaction. News Story

202 Release date: September 14, 2005 STMicroelectronics and Mobidiag Unveil Lab-on-Chip for Rapid Bacterial Diagnosis Boston, September 14, STMicroelectronics (NYSE: STM) and Mobidiag today introduced a new lab-on-chip application for DNA-based detection of sepsis-causing bacteria, using a diagnostic panel from Mobidiag that runs on ST's In-Check platform. Providing faster and more reliable results at a fraction of cost and complexity of conventional laboratory systems, the miniaturized compact solution enables early detection of disease, resulting in better treatment choices for patients and lower overall costs to the healthcare systems. The In-Check platform hosts a pathogen panel developed by Mobidiag to identify ten sepsis-causing bacterial species as well as methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus from positive blood culture samples. The diagnostic panel has been designed to optimize the choice of antibiotic therapy in combination with results from Gram-staining, an empirical comparative method of differentiating bacterial species. As a result, highly accurate and rapid results from the ST/Mobidiag solution will reduce the risks of antibiotic misuse and help physicians select the right treatment as early as possible. ST In-Check lab-on-chip platform amplifies clinically relevant DNA samples by Polymerase Chain Reaction (PCR) and has an integrated custom low-density microarray. Microreactors buried in the micro-electro-mechanical-system (MEMS) chip carry the mixture of sample and reagents, while on-chip heating elements perform the temperature cycling. Silicon's low thermal capacity and the In-Check design features significantly reduce reaction times and costs, compared with standard laboratory Advertisement equipment. The risks of cross- contamination inherent in conventional analysis methods are minimized, too, as the PCR and analysis is performed on chip in an encapsulated, self-contained unit. The lab-on-chip interfaces to the Thermal Control System (TCS) that actuates, monitors, and adjusts the parameters of the reaction. The TCS unit comprises five

203 The lab-on-chip interfaces to the Thermal Control System (TCS) that actuates, monitors, and adjusts the parameters of the reaction. The TCS unit comprises five control modules with independent thermal protocols and random access capability. Optical signal acquisition is performed by a dedicated portable reader and processed by ST's specialized bioinformatics software, which can be installed on any PC and operates with Mobidiag's clinical reporting user interface. This software package allows users to easily monitor and control the reaction processes, analyze the results, and generate reports compliant with MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment) standards for unambiguous interpretation of data from DNA tests. "The unique combination of ST's leading-edge semiconductor and MEMS expertise with Mobidiag's know-how in microbiological diagnostics opens new possibilities for effective detection and treatment of infectious diseases at the point of need," said Anton Hofmeister, Group Vice-President and General Manager for ST's Microfluidic Division. "We believe that affordable, user-friendly, and portable devices like the In-Check are set to make a critical difference in a growing number of diagnostic applications." "Early detection of systemic bacterial infections is essential for the successful management of antibiotic therapy, and we look forward to addressing the needs of laboratories that perform millions of blood cultures every year in our target markets," added Jaakko Pellosniemi, CEO of Mobidiag. "The In-Check platform is ideally suited to exploit the advantages of Mobidiag's unique diagnostic microbiological panels. Our product will markedly improve the quality of treatment choices, leading to better patient outcomes and reduced healthcare costs." After one year of joint development based on early prototypes, first units of In-Check lab- on-chips together with the control instruments are now shipping to Mobidiag for validation. Clinical trials are planned for early 2006, with the final product including validated controls, assay optimization, and diagnostic reporting software to be launched later next year. About Mobidiag Mobidiag, based in Helsinki, Finland, develops proprietary biochip assays for common infectious diseases, such as sepsis, pneumonia, and meningitis. In addition to bacterial pathogens the company has also developed methods to identify antibiotic resistance markers with biochip technology. In the longer term, Mobidiag will focus on providing rapid point-of-care (POC) solutions for diagnosing high-incidence outpatient diseases, including respiratory and urinary infections. Further information on Mobidiag can be found at

204 STMicroelectronics and Mobidiag Unveil Lab-on-Chip for Rapid Bacterial Diagnosis Wednesday September 14, 6:00 am ET Faster, Less Expensive, and More Accurate Detection of Infectious Diseases Will Lead to Better Treatment Choices ST at Chips-to-Hits, Boston Convention & Expo Center, September,

205 The Prove It products are based on biochip technology combining an optimized broad-range PCR method and DNA microarrays in a miniaturized, integrated format. Mobidiag has partnered with STMicroelectronics to provide a complete diagnostic solution including biochip assays, instrumentation as well as analysis software for the interpretation of results. In a conventional laboratory the complete analysis process requires bulky and costly equipment and often takes 2-3 days. With the Prove It biochip system, the whole process can be completed in 2.5 hours, including all sample preparation steps. In addition, the Prove It tests require only very small quantities of the costly reagents used for DNA tests.

206 One platform - multiple applications The Prove It product family offers unprecedented speed and accuracy for microbial diagnostics. The first Prove It biochips are targeted at life- threatening bacterial infections such as sepsis and pneumonia. The test panels are designed to include the most common pathogens causing these bacterial infections worldwide as well as clinically relevant antibiotic resistance markers.

207 Key advantages of Prove It products Simultaneous detection of a large number of disease markers Results in 2.5 hours Suitable for several sample types and different applications Increased accuracy and reliability compared to currently available diagnostic methods Compact and affordable equipment

208 Mobidiag develops the innovative Prove It DNA diagnostic solution for the detection of microbes and antibiotic resistance. The key benefits of Mobidiags new biochip technology for clinical laboratories are speed, accuracy, and ease of use. The first biochips, developed in collaboration with platform partners, will be available in Europe in The mission of Mobidiag is to improve the quality of healthcare and fight antimicrobial resistance by providing rapid and reliable molecular diagnostic assays and devices for infectious disease testing. The companys products provide fast and accurate information about infections to enable more enlightened treatment decisions and better patient outcomes. News: September 15, Mobidiag and STMicroelectronics unveil Lab-on-Chip for Rapid Bacterial Diagnosis [Read More][Read More] Mobidiag ja STMicroelectronics julkistavat uuden biosirun bakteerien diagnosointiin [Lue Lisää][Lue Lisää]

209 Products Lab-Arraytor(R) human 60-1 Lab-Arraytor(R) human 60-2 Lab- Arraytor(R) human 60-3 Lab-Arraytor(R) human 60-4 Lab-Arraytor(R) human 60-5 Lab-Arraytor(R) human 60-6 Lab-Arraytor(R) human 60- Inflammation Lab-Arraytor(R) Training Trademarks: Lab-Arraytor(R) ; Sep-Arraytor(R); Immun-Araytor(R); SepNet(R Cooperation Partner Clinical Centre FSU Jena Hans-Knöll-Institute Jena German Sepsis Society

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235 Newest breakpoints NCCLS;M2-A8 for Streptococcus pneumoniae vs B-lattamici S I R Penicillin 2

236 S I R Amoxicillin or 8 amoxicillin-clav.ac < 2/1 4/28/4 Cefepime 4 (nonmeningitidis) There is not a U.S.FDA-approved indication for the use of cefepime for meningitidis Cefepime 2 (meningitidis)

237 S I R Cefotaxime or 2 ceftriaxone 2 (meningitidis) Use of cefotaxime or ceftriaxone in meningitidis requires therapy with maximum doses Cefotaxime or 4 ceftriaxone (nonmeningitidis) For cefotaxime, use of interpretative criteria for nonmeningitidis requires doses appropriate for serious pneumococcal infections :at least 1 g (adult) or 50 mg/kg (children) every eight hours or more frequently

238 Volume 11, Number 6, June 2005 Integrating Escherichia coli Antimicrobial Susceptibility Data from Multiple Surveillance Programs John M. Stelling,* Karin Travers,* Ronald N. Jones,§ Philip J. Turner,¶ Thomas F. O'Brien,* and Stuart B. Levy*§ *Alliance for the Prudent Use of Antibiotics, Boston, Massachusetts, USA; Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts, USA; The Jones Group, North Liberty, Iowa, USA; §Tufts University, Boston, Massachusetts, USA; and ¶AstraZeneca, Macclesfield, Cheshire, United Kingdom

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