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TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la crescita di un particolare.

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Presentazione sul tema: "TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la crescita di un particolare."— Transcript della presentazione:

1 TERRENO DI COLTURA Miscela di composti biologici o sintetici, organici o minerali, capace di fornire un ambiente ottimale per la crescita di un particolare tipo di microrganismo

2 TERRENI DI COLTURA I microrganismi vivono in natura in popolazioni che sono dette miste, costituite da unampia varietà di differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di coltura deve contenere principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, ossigeno atmosferico,ecc. I microrganismi vivono in natura in popolazioni che sono dette miste, costituite da unampia varietà di differenti tipi di microbi. I microrganismi necessitano di ambienti favorevoli e di sostanze nutritive adatte. Il terreno di coltura deve contenere principi nutritivi essenziali per lo sviluppo di una coltura microbica e deve fornire condizioni ambientali adatte alla crescita, vale a dire condizioni ottimali di: pH, pressione osmotica, ossigeno atmosferico,ecc.

3 TIPI DI TERRENI TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro esatta composizione chimica; sono i più comunemente usati; x es.: Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS. TERRENI COMPLESSI: non si conosce la loro esatta composizione chimica; sono i più comunemente usati; x es.: Brodo Comune, Brodo di Malto, MRS. TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce lesatta composizione chimica; formato da composti chimici puri, aggiunti a concentrazione nota. TERRENI DEFINITI o SINTETICI: si conosce lesatta composizione chimica; formato da composti chimici puri, aggiunti a concentrazione nota. TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: terreni di coltura aventi una combinazione di nutrienti che in combinazione con opportune condizioni fisiche permettono lisolamento di SPECIFICI microrganismi (x es. con luso di antibiotici) TERRENI SELETTIVI o DI ARRICCHIMENTO: terreni di coltura aventi una combinazione di nutrienti che in combinazione con opportune condizioni fisiche permettono lisolamento di SPECIFICI microrganismi (x es. con luso di antibiotici)

4 TERRENI DI COLTURA Nutrient Broth Nutrient Broth Nutrient Agar Nutrient Agar peptone 5 g peptone 5 g estratto di carne 1 g estratto di carne 1 g estratto di lievito 2 g estratto di lievito 2 g sodio cloruro 5 g sodio cloruro 5 g acqua dist ml acqua dist ml Sospendere i componenti in acqua dist. fredda poco a poco per evitare la formazione di grumi, agitare e portare all'ebollizione fino a completa soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4. Sospendere i componenti in acqua dist. fredda poco a poco per evitare la formazione di grumi, agitare e portare all'ebollizione fino a completa soluzione. Aggiustare il pH fino a 7,4. Sterilizzare in autoclave. Sterilizzare in autoclave.

5 X BATTERI X LIEVITI E MUFFE De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI De Man Rogosa Sharpe (MRS) per LATTOBACILLI Peptone from casein 10.0g; Peptone from casein 10.0g; meat extract 8.0g; meat extract 8.0g; yeast extract 4.0g; yeast extract 4.0g; D(+)-glucose 20.0g; D(+)-glucose 20.0g; dipotassium hydrogen phosphate 2.0g; dipotassium hydrogen phosphate 2.0g; Tween® g; Tween® g; di-ammonium hydrogen citrate 2.0g; di-ammonium hydrogen citrate 2.0g; sodium acetate 5.0g; sodium acetate 5.0g; magnesium sulfate 0.2g; magnesium sulfate 0.2g; manganese sulfate 0.04g; manganese sulfate 0.04g; agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g agar-agar (not present in MRS broth) 14.0g acqua dist ml acqua dist ml

6 TERRENI DI COLTURA LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) LIQUIDI: sono chiamati BRODI (BROTH) SOLIDI: contengono AGAR. SOLIDI: contengono AGAR. agar agar - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da unalga - È un polisaccaride contenente zolfo estratto da unalga marina. Reperibile in commercio in forma essiccata pura. Si disidrata facilmente. Ci sono vari tipi di agar che hanno proprietà fisiche diverse. - Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante - Non è un nutriente, ma utilizzato come agente solidificante nei terreni di coltura. Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da molecole di galattosio. Dal punto di vista chimico è un galattano, carboidrato complesso formato da molecole di galattosio. - Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C - Liquefazione a 97/100°C; solidificazione a 42/ 45°C I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature. I terreni agarizzati possono essere incubati a tutte le temperature. Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di silice Possono essere anche utilizzate gelatina o gel di silice

7 CRESCITA IN SUBSTRATI LIQUIDI Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)Mucosità Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4)Mucosità

8 INGLOBAMENTO O INCLUSIONE Il terreno viene seminato mentre è ancora liquido Il terreno viene seminato mentre è ancora liquido

9 I microrganismi ad occhi nudo: crescita in substrati liquidi

10 I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI ( SLANT) Lagar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta obliqua durante il raffreddamento e si presta per essere seminata con lansa o con lago. Sono più facilmente osservabili le colture che producono pigmento Lagar inclinato è una provetta di terreno a base di agar che viene posta obliqua durante il raffreddamento e si presta per essere seminata con lansa o con lago. Sono più facilmente osservabili le colture che producono pigmento

11 I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (SLANT)

12 LA SEMINA DEI TERRENI DI COLTURA SEMINA DI TERRENO SOLIDO SEMINA DI TERRENO SOLIDO SPATOLAMENTO SPATOLAMENTO

13 STRISCIO

14 I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) Se si aggiunge una sostanza solidificante ad un brodo che contiene cellule batteriche, si verificherà che queste rimangono intrappolate ciascuna al proprio posto invece di galleggiare (terreno liquido) e, moltiplicandosi produrrano una massa visibile di cellule, detta COLONIA.

15 I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza, ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi differiscono per misura, colore e struttura.Per questo motivo laspetto di una colonia è importante per lidentificazione di una coltura. Se le cellule si raggruppano ad una certa distanza, ciascuna sarà in grado di sopravvivere e genererà una colonia isolata. Colonie di microrganismi diversi differiscono per misura, colore e struttura.Per questo motivo laspetto di una colonia è importante per lidentificazione di una coltura.

16 I MICRORGANISMI AD OCCHIO NUDO:CRESCITA IN SUBSTRATI SOLIDI (PIASTRE DI PETRI) TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA TECNICA DELLA STRISCIATA SU PIASTRA Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie dellagar di una piastra petri con lansa o con lago incurvato; questa tecnica viene chiamata di trasferimento per striscio ed una piastra così preparata viene detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. Attenzione! Bisogna flambare e Si può trasferire una coltura microbica sulla superficie dellagar di una piastra petri con lansa o con lago incurvato; questa tecnica viene chiamata di trasferimento per striscio ed una piastra così preparata viene detta strisciata. Esistono varie tecniche di striscio su piastra. Attenzione! Bisogna flambare e far lasciare raffreddare lago o lansa far lasciare raffreddare lago o lansa ad ogni passaggio. Lobiettivo della tecnica dello striscio Lobiettivo della tecnica dello striscio è quella di formare da una sospensione di cellule, cellule, delle colonie ben separate.

17 Allinizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre meno sullago, trasferendosi sempre più distanziate sullagar formando colonie sempre più separate. Allinizio di una striscio le cellule sono strettamente compatte, ma con il proseguire lo striscio le cellule rimangono sempre meno sullago, trasferendosi sempre più distanziate sullagar formando colonie sempre più separate. Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dellansa o dellago. Si inizia con una goccia di coltura sul bordo della piastra. Poche strisciate frettolose non producono colonie separate; una buona piastra è il risultato di molti movimenti continui dellansa o dellago. Si inizia con una goccia di coltura sul bordo della piastra. In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma lago per lo striscio o lansa e si raffredda sul bordo dellagar. Si tiene sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia deve essere opposta a voi e strisciate verso di voi In una delle tecniche si sterilizza alla fiamma lago per lo striscio o lansa e si raffredda sul bordo dellagar. Si tiene sempre semicoperta la piastra di petri. La goccia deve essere opposta a voi e strisciate verso di voi

18 CONCETTO DI STERILITÀ STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, STERILIZZAZIONE: distruzione di ogni organismo vivente, (comprese le endospore di Bacillus e Clostridium). DEVE essere assoluta In un laboratorio di microbiologia. Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (tempi di riduzione decimale). DEVE essere assoluta In un laboratorio di microbiologia. Nelle industrie alimentari è un concetto statistico (tempi di riduzione decimale). Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE Il più usato ed efficace strumento per sterilizzare è il CALORE PERCHÉ? Perché le proteine denaturano PERCHÉ? Perché le proteine denaturano Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è: Lo strumento principale di sterilizzazione in microbiologia è: LAUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione LAUTOCLAVE: sterilizza attraverso il vapore sotto pressione (assai più efficace del CALORE secco)

19 LAUTOCLAVE sovrapressione di 1atm = sovrapressione di 1atm =121°C; tempo di 15 minuti tempo di 15 minuti il vapore deve poter entrare il vapore deve poter entrare in contatto con le soluzioni (tappi di cotone; bottiglie aperte) (tappi di cotone; bottiglie aperte) P/T minori e P/T minori e tempi maggiori per limitare il danno ai composti organici (imbrunimento, caramellizzazione) N.B.: Molti zuccheri e N.B.: Molti zuccheri e gli antibiotici devono essere sterilizzati per filtrazione

20 LAVORARE IN STERILITÀ Pipette Pipette Ansa Ansa Spatola Spatola Becco Bunsen Becco Bunsen Si lavora con fiamma ossidante Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile), NON riducente (gialla) NON riducente (gialla)

21 Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere controllati prima dell'uso per contaminazione e data di scadenza. Tutti i terreni di coltura dovrebbero essere controllati prima dell'uso per contaminazione e data di scadenza. Larea iniziale di semina deve ricoprire una superficie compresa fra un terzo ed un quarto dellarea complessiva dellagar utilizzato. Possono essere utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere, a metà od a quattro settori. I campioni devono essere seminati per ottenere colonie isolate, o diffusi direttamente su un intera porzione di una piastra e posti ad incubare senza successiva diffusione del materiale. Larea iniziale di semina deve ricoprire una superficie compresa fra un terzo ed un quarto dellarea complessiva dellagar utilizzato. Possono essere utilizzate in funzione delle circostanze piastre intere, a metà od a quattro settori. I campioni devono essere seminati per ottenere colonie isolate, o diffusi direttamente su un intera porzione di una piastra e posti ad incubare senza successiva diffusione del materiale.

22 Le anse metalliche devono essere flambate portando la loro estremità nella parte inferiore della fiamma di un Bunsen fino a che lintera ansa non assume colore rosso per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto prima del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il loro utilizzo e fra la semina di piastre di agar. Le anse metalliche devono essere flambate portando la loro estremità nella parte inferiore della fiamma di un Bunsen fino a che lintera ansa non assume colore rosso per il calore. Riporle a raffreddare su un supporto prima del loro utilizzo. Ciò può essere eseguito prima e dopo il loro utilizzo e fra la semina di piastre di agar. E consuetudine utilizzare due anse per consentire un adeguato raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura mentre si sta utilizzando laltra ansa. Possono essere utilizzate per ciascuna piastra anse monouso diverse. Le anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di un Bunsen con la parte terminale dellansa rivolta verso basso fino ad arroventarsi, poi rimosse e lasciate raffreddare. E consuetudine utilizzare due anse per consentire un adeguato raffreddamento di ciascuna dopo la flambatura mentre si sta utilizzando laltra ansa. Possono essere utilizzate per ciascuna piastra anse monouso diverse. Le anse di metallo devono essere riscaldate con la fiamma di un Bunsen con la parte terminale dellansa rivolta verso basso fino ad arroventarsi, poi rimosse e lasciate raffreddare. Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile. La piastre per lincubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per prevenire la perdita di vitalità Tutti i terreni devono essere incubati il più presto possibile. La piastre per lincubazione anaerobica devono essere incubate il più presto possibile per prevenire la perdita di vitalità

23 TECNICA ASETTICA Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica asettica risulta importante per evitare la loro contaminazione e proteggere chi lavora da infezione proveniente dal campione. Quando si manipolano campioni o culture, la tecnica asettica risulta importante per evitare la loro contaminazione e proteggere chi lavora da infezione proveniente dal campione. Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato in stretta prossimità per flambare le anse o i fili metallici. Se il lavoro viene svolto su un banco aperto, uno sterilizzatore Bunsen dovrebbe essere collocato in stretta prossimità per flambare le anse o i fili metallici. · Quando si aprono i contenitori delle culture mantenere il campioni lontano dal viso · Quando si aprono i contenitori delle culture mantenere il campioni lontano dal viso

24 INCUBAZIONE DEI MICRORGANISMI I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando Esempi: Esempi: Bacillus stearothermophilus Bacillus stearothermophilus G+, anaerobio facoltativo, termofilo G+, anaerobio facoltativo, termofilo Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium bifidum G+, anaerobio stretto, mesofilo G+, anaerobio stretto, mesofilo Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per h Incubazione a 60°C per 8-12 h Incubazione a 37°C per h Le piastre vanno incubate in posizione capovolta. Le piastre vanno incubate in posizione capovolta. Scrivere nome, data e tipo di contenuto Scrivere nome, data e tipo di contenuto


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