MICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE

Presentazione sul tema: "MICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE"— Transcript della presentazione:

1 MICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE
Sapienza Università di Roma _________________________________________________ Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali MICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE Tesi di Laurea Triennale in Fisica Il titolo della (mia} dissertazione è MICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE. La microscopia vibrazionale coerente, ottenuta combinando insieme un microscopio e uno spettrometro Raman sotto le condizioni dello scattering raman coerente, fornisce un metodo capace di studiare le proprietà chimiche della materia facendo imaging non invasivo e label free, basato sulle vibrazioni molecolari. Ogni componente biologico è infatti caratterizzato da uno spettro vibrazionale che riflette la propria struttura interna in termini di proprietà chimiche. Relatore: Prof. Tullio Scopigno Candidato: Valeria Venturini (matr ) Anno accademico

2 Microscopia Vibrazionale Coerente
Effetto Raman spontaneo e stimolato Scattering Raman Coerente Interazione non lineare radiazione-materia (FWM process) Microscopia Vibrazionale Coerente CARS SRS RIKE Esperimento su acetone Vengono innanzitutto fornite le basi teoriche della microscopia: viene descritto l’effetto Raman, spontaneo e stimolato, lo scattering Raman coerente e l’interazione non lineare tra radiazione e materia di cui in particolare il four wave mixing process. Vengono poi descritte tre tecniche di microscopia: CARS, SRS e RIKE alla base dell’esperimento condotto {che viene descritto e di cui vengono illustrati i risultati. } { Questa dissertazione si pone l’obiettivo di fornire le basi teoriche della microscopia vibrazionale coerente. Verrà innanzitutto descritto l’effetto Raman spontaneo e stimolato, lo scattering raman coerente e l’interazione non lineare radiazione-materia di cui in particolare il four wave mixing process alla base delle tecniche di microscopia vibrazionale coerente ovvero CARS, SRS e RIKE.Viene infine descritto un esperimento su acetone. } Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 2

3 Effetto Raman spontaneo
Quando una radiazione monocromatica a frequenza omega_0 incide su campione, essa interagisce con i moti rotovibrazionali delle molecole e si osserva che la luce incidente non è diffusa solo a frequenza omega_0 a cui corrisponde lo scattering elastico o Rayleigh, ma anche a frequenza omega_0 +- una caratteristica frequenza vibrazionale del campione, che corrispondono rispettivamente allo scattering anelastico a frequenza anti-Stokes e Stokes. Questo accade perché la luce incidente induce una fluttuazione nei contributi elettronici alla polarizzabilità e si ottiene che il momento di dipolo indotto è formato da tre termini: da questo si generano i fotoni a frequenza stokes e anti stokes. Condizione necessaria affinchè una molecola sia Raman attiva è quindi che possa avere un cambiamento nella polarizzabilità, ovvero nella forma o nell’orientazione della nuvola elettronica, e la frequenza incidente deve essere diversa da quelle in assorbimento, altrimenti questo fenomeno schermerebbe comlpetamente il Raman, e molto maggiore delle tipiche frequenze rotovibrazionali perché, se così non fosse, la luce incidente non vedrebbe la rotazione e la vibrazione ma solo le loro medie temporali. Il segnale è debole ovvero molto meno intenso di altri fenomeni che lo schermano. Per questo motivo si introduce l’utilizzo di un ulteriore fascio Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 3

4 Effetto Raman Stimolato
Coherent Raman Scattering Nell’effetto Raman stimolato, quando le frequenze dei due fasci, la pompa Raman a omega_p e lo stokes probe a omega_s sono in risonanza con una caratteristica frequenza vibrazionale del campione si ottiene luce coerente diffusa collinearmente al probe e con sezione d’urto molto maggiore di quella raman spontanea. Il Raman stimolato è alla base dello scattering raman coerente in cui: un primo set di laser a frequenza diversa ma la cui comb lineare coincide con la frequenza vibrazionale induce uno stato collettivo di vibrazione coerente: le molecole oscillano quindi in fase e questo fa si che il segnale sia di molti ordini di grandezza più grande di quello raman spontaneo. Un secondo impulso , il probe, interagisce con il campione e modula la coerenza vibrazionale generata nel primo step. Nelle tecniche CRS con due laser nel primo step si ha: [vedi equazione] ed è pertanto un four wave mixing process. E’ un processo non lineare del terzo ordine nel quale tre segnali a frequenza omega1, omega2, omega3 interagiscono per dare origine ad un segnale a frequenza omega4. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 4

5 Interazione non lineare radiazione-materia: Four Wave Mixing process
Il FWM è descritto da un sistema di quattro equazioni differenziali accoppiate: mostra che l’evoluzione di ciascun campo coinvolto è correlata all’andamento degli altri tre [alfa_i è la costante di accoppiamento e in condizioni di conservazione del momento (phase matching) Deltak->0 si minimizza la perdita di segnale.] Questo processo è alla base delle tecniche spettroscopiche che descriveremo. In generale gli effetti non lineari entrano in gioco quando le intensità coinvolte nell’interazione radiazione materia sono così elevate che gli elettroni sono dislocati dalla loro posizione di equilibrio e il potenziale di richiamo non è più nell’approssimazione armonica. Ne segue che la polarizzazione, che esprime la risposta del mezzo attraversato dall’onda associata al campo E, è espressa in serie di E(t). Il termine del primo ordine spiega i fenomeni di riflessione, rifrazione, assorbimento e emissione di un fotone mentre gli altri i fenomeni non lineari ed in particolare il termine del terzo ordine spiega la generazione di terza armonica, il fwm e l’assorbimento a due fotoni. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 5

6 Coherent Anti-Stokes Raman Scattering
Lo scattering Raman coerente a frequenza anti-Stokes (CARS) è una tecnica CRS in cui il segnale è generato a frequenza diversa di quelle di pump e Stokes, motivo per cui è facile da rivelare. L’interazione è coerente se omega_p-omega_s=Omega e il segnale è generato a omega_as=2omega_p-omega_s. Applicando il FWM process si ottiene il valore per l’intensità del segnale a freq anti-Stokes: la presenza della funzione sinc fa si che sia grande per Deltak<<pi quindi al limite, per Deltak->0 che corrisponde alla condizione di phase matching, la sinc->delta di Dirac. Il segnale è inoltre proporzionale al quadrato della concentrazione (perché la scuscettività è propto N). La suscettività elettrica del terzo ordine può essere scomposta nel contributo risonante, che dipende dalla frequenza e assume il suo massimo valore in condizioni di risonanza, e quello non risonante che è circa indipendente dalla frequenza. La conseguenza della presenza di questo termine è quella di distorcere e disturbare il segnale ed costituisce la principale limitazione del CARS. Termine risonante=informazioni chimiche e quantitative; termine non risonante=dipende dalle proprietà elettroniche del materiale Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 6

7 Background non risonante (NRB)
In figura è mostrato il confronto tra il cars e l’srs, rispettivamente on- e off- resonance (rispettivamente a sinistra e destra) di uno strato di cornea di un topo (legame CH2). E’ evidente che quando si sta in condizioni off resonance il segnale SRS, che è, come vedremo, privo del contributo non risonante, scompare completamente mentre nel caso del cars resta il contributo non risonante. Questo è un segnale “falso” che rende più complicata l’interpretazione delle immagini e limita la sensibilità. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 7

8 Tecniche di soppressione del NRB
Frequency Modulation - CARS Polarization - CARS Esistono numerose tecniche di soppressione del contributo non risonante, utilizzate a seconda delle condizioni in cui si lavora. Tra queste: il Frequency Modulation CARS sfrutta l’andamento in frequenza dei due termini della suscettività. Variando la frequenza dello stokes a partire dalle condizioni di risonanza, il cars diminuisce improvvisamente mentre il NRB resta all’incirca costante, e modulando la frequenza tra quella di risonanza ed un altro valore. si misura nel primo caso il cars e il suo contributo nr e nell’altro caso solo il contributo nr ottenendo così una misura del CARS. Il Polarization CARS invece sfrutta le differenti polarizzazioni dei due contributi: ponendo un analizzatore nella direzione ortogonale alla polarizzazione non risonante si misura la proiezione della polarizzazione risonante su tale direzione. Il segnale rivelato ha pertanto una bassa intensità ed il metodo in generale è disturbato dalla birifrangeza generata dagli elementi ottici. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 8

9 Stimulated Raman Scattering
Nello scattering Raman stimolato, come abbiamo visto, non si ha la generazione di un segnale ad una nuova frequenza, ma si ha la creazione dell’impulso di Stokes, che si misura con lo stimulated raman gain, e l’annichilazione dell’impulso di probe, che si misura con lo stimulated raman loss. Applicando il FMWprocess si ottengono le espressioni per queste due quantità: esse dipendono esclusivamente dal contributo risonante della suscettività del terzo ordine e sono pertanto proporzionali alla concentrazione delle molecole N e non resonant background-free, ma sono sensibili alle oscillazioni di pump e Stokes che ne costituiscono il background lineare. E’ inoltre difficile da rilevare: si utilizzano contemporaneamente un modulatore e un amplificatore lockin. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 9

10 Raman Induced Kerr Effect
RIKE lineare: il pump è polarizzato a 45° rispetto allo Stokes; RIKE circolare: il pump è polarizzato circolarmente. Il RIKE è una tecnica simile all’SRS ma pump e stokes hanno polarizzazioni diverse. In condizioni di risonanza si inducono effetti raman di birifrangenza che modificano il campo di stokes. Nel caso lineare il pump è polarizzato a 45° rispetto allo stokes e nel caso circolare il pump è polarizzato circolarmente. Applicando il FWMp si ricava l’espressione per la variazione dell’intensità dello Stokes nella quale bisogna però tener conto della polarizzazione dei segnali e considerare la suscettività del 3 ordine come un tensore di rango quattro dove ciascun indice rappresenta uno dei quattro campi coinvolti: si ottiene un’espressione per ciascun caso. Il RIKE lineare dipende da termini risonanti e non, mentre nel caso circolare dipende dai soli contributi risonanti. Introducendo la suscettività efficace che corrisponde ai termini nelle parentesi quadre possiamo scrivere un’espressione per l’intensità del RIKE. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 10

11 Raman Induced Kerr Effect
Balanced-detection (BD) A livello sperimentale, il RIKE nella sua versione balanced detection unisce i vantaggi di CARS come il fatto di essere linear-background free e dell’ SRS come la dipendenza lineare dalla concentrazione e l’assenza del contributo non risonante. Fornisce inoltre informazioni sulla fase vibrazionale, rivelando parte reale e immaginaria della suscettività non lineare e attenua il rumore del laser. Le lamine sono entrambe lambda/2 o lambda/4 nel caso lineare o circolare rispettivamente. Opportuni filtri bloccano il pump per poter rivelare le variazioni dello stokes, e un prisma Wollaston separa il fascio in due componenti di polarizzazione ortogonale che vengono rilevate dal diodo bilanciato. Quando non si è in condizioni di risonanza o il pump è bloccato dal modulatore, le due componenti rilevate sono tra di loro uguali quindi il segnale è nullo, mentre, quando è generato il segnale RIKE, lo stokes cambia leggermente la sua polarizzazione e il diodo, collegato all’ampliicatore Lock-in, rivela due intensità diverse. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 11

12 Confronto CARS SRS RIKE BD- vantaggi svantaggi Linear background free
Facile da rilevare NRB-free ∝ N NRB-free nel caso circolare Non resonant background (NRB) ∝ N2 Background lineare Difficile da rilevare NRB nel caso lineare BD- vantaggi Attenua il rumore del laser e fornisce informazioni sulla fase vibrazionale Ricapitoliamo quindi principali vantaggi e svantaggi delle tre tecniche di microscopia descritte e sottolineiamo ancora una volta i vantaggi della balanced detection. La diretta proporzionalità del segnale nei confronti della concentrazione delle molecole è un vantaggio se si lavora alle basse concentrazioni ed è preferibile per poter ricavare il valore di N. La proporzionalità verso il quadrato della concentrazione diventa vantaggiosa al crescere di N. svantaggi Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 12

13 Apparato sperimentale
L’esperimento a cui ho collaborato è stato condotto nei laboratori dell’Istituto Italiano di Tecnologia ed è capace di eseguire le tecniche di microscopia appena descritte. Una volta che è stato assemblato l’apparato sperimentale, dopo aver allineato, filtrato e focalizzato i fasci, dopo aver sovrapposto i due impulsi spazialmente e temporalmente, sono stati eseguiti uno spettro CARS e uno BD-RIKE su acetone, di cui riportiamo i risultati ottenuti, per verificare il corretto funzionamento dell’apparato prima di studiare il grafene. L’assetto del banco ottico è mostrato in figura. L’uscita del laser a a λ=1064nm è il segnale fisso di stokes mentre la sua seconda armonica serve per pompare l’OPO la cui uscita è il segnale tunabile utilizzato come pump. Lo Stokes deve recuperare il percorso che il pump compie nell’OPO per poter sovrapporre i due segnali spazialmente, anche grazie alla delay line, e temporalmente, con l’utilizzo di un oscilloscopio in funzione di trigger esterno collegato al laser stesso. Il modulatore, collegato ad un amplificatore lock-in, a sua volta collegato ad un generatore di segnali ad ondra quadra, serve per poter misurare il segnale di stokes in presenza o no dell’OPO). E lo specchio tagliato fa si che si possano misurare le caratteristiche dell’OPO tramite lo spettrometro. Le due lamine lambda/2 servono per il rike lineare altrimenti i due impulsi sono polarizzati verticalmente. Una volta che essi sono sovrapposti vengono fatti passare per il primo obiettivo, per il campione e per il secondo obiettivo e il segnale viene poi rilevato. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 13

14 Apparato sperimentale
Per quanto riguarda la rilevazione del segnale, essa è divisa in due parti. Nel caso del CARS il segnale viene fatto riflettere e una volta aver bloccato con opportuni filtri le componenti a frequenza minore di quella anti-stokes, ovvero pump e stokes, viene rilevato con l’utilizzo di uno spettrometro. Per il BD-RIKE il segnale viene fatto procedere e dopo esser filtrato, bloccando il pump, e fatto passare per la lamina e per il cristallo non lineare (Wallaston o Glann Thompson) viene focalizzato e rilevato dal diodo bilanciato. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 14

15 Risultati Microscopia Vibrazionale Coerente 25 Settembre 2014 pag. 15
2917 I dati CARS sono stati acquisiti con uno spettrometro che da come output la lunghezza d’onda lambda e l’intensità e si sfruttano le condizioni di risonanza e fwm del cars per ottenere il raman shift. Lo spettro ottenuto mostra un picco a 2917 cm^-1. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 15

16 Risultati Microscopia Vibrazionale Coerente 25 Settembre 2014 pag. 16
Idiodo / IOPO Idiodo Per quanto riguarda il RIKE, un programma legge l’output dell’OPO l’output del diodo e restituisce come dati: la lunghezza d’onda dell’OPO, l’intensità dell’OPO, l’intensità del diodo bilanciato e l’intensità del diodo normalizzata a quella dell’OPO che non è costante nel tempo. Dalle condizioni di risonanza si ricava il Raman shift. Nella prima figura è mostrato lo spettro del RIKE considerando l’intensità del diodo bilanciato mentre nel secondo quella normalizzata all’intensità dell’OPO. Il RIKE ha un picco a 2911cm^{-1}. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 16

17 Risultati Microscopia Vibrazionale Coerente 25 Settembre 2014 pag. 17
2918 E’ possibile infine confrontare i due spettri ottenuti con il Raman dell’acetone che mostra un picco a 2918 cm^-1 che corrisponde all’eccitazione del legame CH3. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 17

18 Confronti Microscopia Vibrazionale Coerente 25 Settembre 2014 pag. 18
In figura è mostrata la sovrapposizione tra il cars e il raman teorico: questi sono completamenti sovrapposti, ma come accade per il rike, il nostro apparato non è in grado di rilevare i picchi secondari alla base di quello principale. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 18

19 Confronti Microscopia Vibrazionale Coerente 25 Settembre 2014 pag. 19
Questo accade perché il potere risolutivo non è sufficiente a risolverli. Bisogna inoltre ricordare che la riga di emissione del laser non è una delta ma una gaussiana e pertanto vediamo la convoluzione tra questa gaussiana e lo spettro reale. Le nostre misure sono comunque consistenti con l’andamento atteso. [Per quanto riguarda il campione il principio di indeterminazione tempo energia (che collega il tempo di vita medio di uno stato eccitato con la precisione della sua energia) e l’effetto doppler (per cui atomi con velocità diverse assorbono fotoni di energia diversa) sono altre fonti di errore.] Possiamo comunque sostenere che i nostri spettri sono consistenti con lo spettro teorico. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 19

20 Prospettive future Ambito in crescita Applicazioni: Medicina
Biochimica Farmacologia Beni culturali Possiamo concludere affermando che la microscopia vibrazionale coerente è un ambito di ricerca in notevole crescita grazie al continuo sviluppo delle tecnologie, in particolare dei laser, e che mostra sempre più applicazioni in numerosi campi come la biochimica (nello studio della cellula), farmacologia e beni culturali (nello studio dei pigmenti pittorici) ma soprattutto in medicina nello studio delle differenze tra tessuti sani e malati. Microscopia Vibrazionale Coerente Settembre pag. 20