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Esame batteriologico Finalità: Ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili di processi infettivi Identificarli e determinare la loro sensibilità.

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Presentazione sul tema: "Esame batteriologico Finalità: Ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili di processi infettivi Identificarli e determinare la loro sensibilità."— Transcript della presentazione:

1 Esame batteriologico Finalità: Ricercare in modo rapido ed accurato gli agenti responsabili di processi infettivi Identificarli e determinare la loro sensibilità agli antibiotici

2 opportunista opportunista patogeno patogeno normale popolazione residente

3 m etodi rapidi di identificazione preliminare Microscopici: esame a fresco: vetrino + coprioggetto vetrino a goccia pendente colorazioni: Gram, Blu di metilene inchiostro di china Immunologici: reazione Anticorpo/Antigene Biologia Molecolare

4 scelta dei terreni, semina dipende dalla sede dell’infezione e dell’atteso patogeno responsabile

5 t erreni di c oltura Terreni solidi in piastra:  arricchiti  selettivi  differenziali Terreni solidi in provetta Terreni liquidi

6 6 I terreni possono essere acquistati già pronti oppure la preparazione può avvenire in laboratorio con polveri che si trovano in commercio Le istruzioni per la preparazione sono riportate sulla confezione o su appositi manuali per terreni particolari e più complessi

7 7 Substrati solidi (piastre Petri)

8 s emina

9 9 Terreni nutrienti permettono la crescita della maggior parte dei microrganismi Terreni selettivi permettono la crescita solo di alcune specie Terreni differenziali permettono la discriminazione di una specie dall’altra grazie ad opportuni indicatori

10 10 Agar Sangue Terreno nutriente con 5 % sangue di montone non permette la crescita di Haemophilus, Neisseria, micobatteri, Bordetella, Francisella, Legionella Streptococcus pyogenes

11 e molisi parziale, viridante  totale

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13 13 Agar cioccolato Terreno nutriente e selettivo con sangue di cavallo (il sangue è fatto scaldare a 80°C per permettere la rottura dei globuli rossi e la liberazione nel terreno di ematina e NAD) Permette la crescita della maggior parte dei batteri ma in particolare dell’ H. influenzae e delle Neisserie.

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15 15 Mc Conkey Selettivo per enterobatteri Sali biliari e cristalvioletto inibiscono la crescita di batteri gram positivi Lattosio e rosso neutro consentono di differenziare gli enterobatteri fermentanti (es. E. coli) dai non fermentanti (es. Acinetobacter)

16 16 Enterobatteri non fermentantiEnterobatteri fermentanti

17 17 Agar sale-mannitolo Selettivo/differenziale Contiene NaCl, mannitolo, rosso fenolo Utilizzato per isolare stafilococchi e streptococchi, inibisce la crescita della maggior parte degli enterobatteri. Staphylococcus aureus

18 18 Agar sale-mannitolo

19 19 Agar Thayer Martin Terreno selettivo per Neisserie patogene (N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. lactamica), gli altri batteri sono per la maggior parte inibiti. Contiene vancomicina (3mg/l), colistina (7.5 mg/l), nystatina (12.53 mg/l), trimetoprim (15.3 mg/l)

20 20 Agar Shigella/Salmonella (XLD) Agar selettivo/differenziale per patogeni enterici Contiene xiloso, lisina, desossicolato. Salmonella spp. Klebsiella pneumoniae

21 21 Sabouraud agar Isolamento miceti Aggiunta di ampicillina 0.5% e cloramfenicolo 2% Per la differenziazione di C. albicans dalle altre specie si aggiunge inoltre fenolftaleinadifosfato 5% e verde metile 0.5%

22 22 Terreni liquidi Tioglicolato: agente riducente che allontanando l’ossigeno dal terreno soddisfa le esigenze nutritive della maggior parte dei batteri anaerobici. Brain heart: contiene estratti di cuore, cervello, peptone, destrosio, NaCl. È particolarmente nutritivo per la crescita della maggior parte dei microrganismi inclusi streptococchi e pneumococchi. Triptyc soy broth: contiene triptone, soia, NaCl. Brodo selenite: contiene triptone, lattosio, selenite. È utilizzato per favorire la crescita di Shigella e Salmonella. Mueller Hinton: utilizzato per i saggi di sensibilità agli antibiotici.

23 Terreni differenziali Contengono sostanze che rilevano le attività biochimiche caratteristiche dei germi (es. fermentazione, idrolisi) (A.lattosio, cromogeni). Alcuni terreni selettivi (MSA, Bile) sono anche differenziali. Terreni cromogeni

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25 colorazioni La colorazione in batteriologia, introdotta verso la metà del XIX secolo, è stata in gran parte responsabile dei grandi progressi che si sono verificati nella microbiologia. I coloranti derivano da tre composti organici: C 6 H 5 -CH 3 toluene C 6 H 5 -OH fenolo C 6 H 5 -NH 2 anilina e sono divisi in due grandi categorie: acidi e basici, i batteri sono basofili quindi vengono usati coloranti basici

26 colorazioni  blu di metilene  Ziehl-Neelsen  violetto di genziana (Gram)  metacromatica

27 colorazione di GRAM blu / violetto gram positivi rosso gram negativi

28 gram positivi Bastoncini (lattobacilli)

29 stafilococchi gram positivi

30 streptococchi gram positivi

31 gram negativi bastoncini

32 antibiogramma Determinazione della sensibilità dei germi agli antibiotici diluizione in provetta diffusione in Agar (Kirby-Bauer) (metodo standard)

33 33 Mueller-Hinton agar Estratto di carne, casaminoacidi,lievito Utilizzato per saggiare la sensibilità dei microrganismi agli antibiotici

34 Kirby Bauer d d2d2

35 E -test

36 Un paziente ospedalizzato può veicolare un ceppo nosocomiale per oltre 6 mesi dalla dimissione E’ ancora affetto da infezione o è diventato un portatore sano? Scanvic et al, 2001; Marchese, 2004

37 Metagenomics As a result, the genetic and biological diversity of microorganisms is an important area of scientific research. Unfortunately, scientists are able to grow LESS THAN 1% of all microorganisms observable in nature under standard laboratory conditions. This leaves scientists unable to study more than 99% of the biological diversity in the environment

38 Dinamica delle Popolazioni Batteriche 38 VBNC: attivazione di uno stato vitale ma non coltivabile Internalizzazione:  -lattamici e aminoglicosidi non entrano all’interno delle cellule (Ig, PMN) Induzione di forme filamentose

39 39

40 40

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42 Rappresentazione schematica della divisione di cellule bastoncellari o coccoidi I batteri si dividono per scissione binaria Il tempo di divisione (generazione) della cellula batterica è molto variabile e dipende dalla specie e dal terreno di coltura Ad es. E. coli può dividersi ogni 20 min, in una notte oltre 20 generazioni (circa 500 anni per un uomo) M. tuberculosis ha un tempo di generazione di circa 24 ore

43 Dinamica delle Popolazioni Batteriche Laboratorio di Microbiologia Sperimentale ed Epidemiologia 43 Durante questo periodo molti caratteri di patogenicità e virulenza e di resistenza agli antibiotici possono essere persi specie se veicolati da plasmidi

44 44 L’intenso uso di antibiotici non incide solamente sull’evoluzione delle resistenze, ma anche sulla fisiologia dei microrganismi

45 45 Curva di crescita di un ceppo veicolante un plasmide Il ceppo J53 è un E. coli in grado di ospitare un plasmide (es. R64) o altro simile ma di P.M. superiore. In ogni caso la semplice aggiunta di altro materiale genetico incide sulla velocità di crescita. D.O. Tempo

46 46 Ceppo selvaggio e suo derivato resistente alla rifaximina

47 47 Il ceppo resistente risulta subire gli stessi effetti del ceppo sensibile ma a concentrazione maggiore

48 48 Enterobatteri Costo biologico della resistenza Fitness batterica: concetto complesso da definire comprende molte componenti: Tasso di crescita (test COMPETIZIONE) Virulenza (test in vivo, espressione fattori di patogenicità) Andersson e Levin, Curr Opin Microbiol, 1999; Andersson Curr Opin Microbiol, 2006

49 49 Enterobatteri fosfomicino-R Costo biologico ceppi mutanti di E. coli e K. pneumoniae rispetto agli isogenici:  hanno ridotta velocità di crescita  sono più sensibili alla fagocitosi  Modificata idrofobicità di superficie Li Pira, Pruzzo e Schito Eur. Urol, 1987

50 50 Conclusions Thus, reversibility studies at both the individual and community level indicate that often resistant bacteria are able to persist for a long time, even if no antibiotic selective pressure is present. Compensatory evolution, cost-free mutations and co-selection of resistance markers provide likely explanations for this poor reversibility.

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52 52 Although the acquisition of resistance genes frequently comes at a cost to fitness, especially when a plasmid is transferred, antibiotic- resistant pathogens rapidly acquire compensatory mutations that restore their full competitive fitness and virulence (Fig 2).

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54 54 E. Peter Greenberg, 1997, Quorum sensing in Gram-negative bacteria ASM News, 7: “It has been said that every novel idea in science passes through three stages. First people say it isn’t true, then they say it’s true but not important, and finally they say that it’s true and important, but not new.”


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