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I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento.

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1 I geni della catena pesante delle immunoglobuline mappano sul cromosoma 14 q32 Il verso di orientamento della trascrizione è lo stesso del riarrangiamento e class switch. Il sistema di trascrizione, riarrangiamento (ricombinazione), switch isotipico, maturazione del linfocita vanno di pari passo, per cui c’è interazione tra antigeni di membrana (IgM prima e IgX dopo lo switch) e cellula B e anche tra cellula B con gli altri recettori per interleukine ed altri fattori intra ed extra cellulari. Lez Esercitazioni e Aprile 2007 Il sistema regolatorio “cis acting” delle catene pesanti delle Ig umane

2 Come funziona il controllo “cis” della catena pesante delle Ig Aggiornamenti dopo il sequenziamento del genoma umano e di topo Sequenze“cis” regolative genomiche (né tradotte né trascritte) servono da segnale per i fattori ed enzimi per : - i riarrangiamenti delle regioni variabili e lo switch isotipico - la trascrizione dei geni sia in fase di maturazione (trascritti sterili) che nella plasmacellula e della memoria - interagisce con i sistemi di controllo extra ed intra-cellulare di maturazione e proliferazione con feed-back per segnali verso altre cellule e da altre cellule forse con segnali di molecole che fungono da secondi messaggeri - con i fattori di trascrizione rende mobile la cromatina intorno

3 Importanza della regolazione delle Ig I - interazione col sistema immune nelle funzioni fisiologiche e patologiche Come in ogni sistema l’importanza primaria stà nella funzione primaria in se (in questo caso le Ig) Poi ci sono le funzioni che sono correlate e dipendono da questa prima funzione Interazioni con le funzioni dei linfociti B, T, ecc. Altri sistemi correlati (snc, digerente …)

4 Chi dice al linfocita quale “switch” fare E se lo “switch” è casuale quale è il segnale selettivo per cui nei distinti distretti restano i linfociti che producono un certo tipo di Ig Molte risposte sembrano essere correlate con gli effettori ed effetti della trascrizione delle Ig

5 Cosa si può chiedere A monte e a valle della trascrizione delle Ig cosa c’è e quali metafunzioni svolge Avolte si conosce l’esecutore e non il mandante, spesso nessuno dei due. Per ora cerchiamo dei possibili esecutori Le tracce che stiamo cercando nel nostro caso sono sulla organizzazione della regione regolatrice e quindi sul genoma direttamente sul locus delle Ig Forse è un quadro intermedio con responsabilità del settore “risposta umorale”

6 L’organizzazione genomica Il sito delle catene pesanti delle Ig sta sul crms 14 q32, anche le catene leggere hanno la loro importanza relativa Stiamo studiando la regione regolativa della trascrizione delle catene pesanti Lo studio è iniziato con la descrizione da parte di tre gruppi che lavorano sulle immunoglobuline umane del polimorfismo dell’enhancer centrale del complesso regolatore. 2 americani ed 1 francese

7 Il sito delle Ig umane è poco diverso dal topo Nei primati (dalle scimmie antropomorfe) è presente la duplicazione dei 4 geni delle regioni costanti Ig  3, Ig  1, Ig , Ig  1 Nel topo la regione regolativa che ha un enhancer in più è definita LCR, ma per analogia non si può dire lo stesso nell’uomo finchè non si dimostri che è locus indipendente e numero dipendente (effetto quantitativo) secondo la definizione di LCR, perciò si definisce Regulative Region RR vedi la figura della mappa del locus

8 strutture regolatrici delle catene pesanti delle Ig umane telomero Chromosome 14q32 enhancer 5’  3 enhancers   33 11 22 44 11   a2 geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili * V D J * regione duplicata reg. variab.*

9 Strutture regolative della trascrizione Elementi regolativi “cis acting” a partire della regione 5’ Somatic hypermutation (SHM) class switch recombination (CSR) 3 regioni regolative principali: promotore di ogni gene V Sequenza conservata evolutivamente delle IgH (ECS) interna (I) al promotore al 5’ di ogni gene costante (C H ) e nelle IgH l’enhancer intronico (iE  ) L’esistenza della regione regolativa al 3’ fu ipotizzata in linee cellulari con delezioni di iE  in cui c’era trascrizione e per delezioni al 3’ in cui diminuiva la trascrizione 

10 bibliografia Henderson and Calame 1998 Ann.rev. Immunol 16, Max E.E. 1999, Fundamental Immunol. Paul W.E. editor 4th edit , Lippincott-Raven, Philadelphia Stavnezer J. 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 245, Honjo T. et al. 2002, Annu. Rev. Immunol. 20, Birshtein B.K.et al 1997, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 224, Khamlichi A.A. et al. 2000, Adv. Immunol. 75,

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13 Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50) Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-) ALLELE 1A 17bp El.END HS1,2 CORE enhancer 17bp El. 38bp Rp 14bp Sp. ALLELE 2A 16bp Sp. ALLELE 3A ALLELE 4A 20bp Sp. ALLELE 3B 31bp El ALLELE 4B Sites for : AP4; E47; MYOD;  E5 Sites for : NF-kB (Q6) Sites for : CMYB M2M1 ALLELE 1 ALLELE 4 ALLELE 3 ALLELE 2 GABGAB CM11CM 4CM 5 GAB 100 bp 400 bp 200 bp 300 bp A B

14 LCR ( nel topo 4 enhancers) IgH3’EC-1/-2 ( nell’uomo 3 enhancers/locus) V D J human chromosome 14 q 32 HS3 HS1,2 HS4 33 11 22 44 11   a2 telomere copia 1 copia 2 mouse Ig heavy locus HS3A HS1,2 HS3B HS4 L C R    aa bb 

15 Chromosome 14 cluster della catena pesante delle Ig IgH3’EC-2 Telomere   33 11 22 44 11   22 SF AL ( 40 kb) CHR77 ( kb) X76785 Y14407 AL AL U64453 IgH3’EC-1

16 PLASMACELLULE Cellule B proliferanti Cellula B attivata (centroblasto) IL-2; IL-4; IL-5; IgG2a o IgG3 IgA o IgG2b IgE o IgG1 IgM IFN-  IL-4 TNF-  IL-2; IL-4; IL-5; Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-  TNF-  Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR)

17 Locus catena leggera Locus catena leggera  Locus catena pesante Cromosoma 22 Cromosoma 2 Cromosoma 14 LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

18 ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE CELLULE B VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti Locus Catene leggere VDJ riarrangiato VJ riarrangiato VJ riarrangiato V-J processing VDJ riarrangiato V-DJ processing D-J processing VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

19 CELLULE B Locus Catene pesanti Locus Catene leggere ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE VJ riarrangiato VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche Plasmacellule Cellule Memoria Cellule B attivate Centrociti VDJ riarrangiato. Le catene  prodotte in forma di membrana Switch isotipico a C , C  o C . Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene  prodotte in forma secreta. Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

20 VHVH DHDH JHJH CHCH Ricombinazione V(D)J V(D)J Risultato dello switchCricolo exciso Ricombinazione class switching (CSR) bb aa V(D)J  IgM IgE     2b 2a Switch region: Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb Il filamento non stampo è ricco in G S , S  ed S  hanno un repeat di 5 bp. S  ha un repeat di 49 bp. Fig. 9 Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

21 ABCDFE Trascrizione regione S RNA editing ? AID? CSR ricombinasi? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di breaks al DNA A B C DF E A B C A B C DF E A B C CSR ricombinasi? Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA Riparazione dei breaks SSSS c-myc una regione S due regioni S Switch su un altro cromosoma traslocazione Class switching recombination A AABBEFC Delezioni intra-switch Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). 12

22 La risposta immunitaria cellulo mediata (linfociti T) umorale (non dell’umore) I linfociti B producono le immunoglobuline della risposta umorale, per poter produrre gli anticorpi specifici devono incontrare l’antigene e deve avvenire una reazione di riconoscimento. Per poi produrre gli anticorpi specifici i linfociti B vanno incontro ad una serie di processi maturativi iniziati prima con l’ematopoiesi e poi con il differenziamento verso cellule pre-B ed infine plasmacellule producenti Ig o cellule memoria (immunita’ acquisita) specifica. L’anticorpo per essere prodotto deriva da una serie di riarrangiamenti somatici dei geni delle immunoglobuline (Ig). Prima si riarrangiano le regioni variabili che corrispondono al 5’ del messaggero che trascrive la Ig e poi con lo switch isotipico la parte costante. La catena leggera non specifica la classe delle Ig. Fig. 1 Se il riarrangiamento della regione variabile e’ produttivo ed ha una reading frame traducibile si ha la produzione di IgM che migrano in membrana per riconoscere un antigene. Il processo e’stocastico.

23 A che serve lo studio della struttura? La struttura e’ alla base della funzione, senza anatomia non si capisce la fisiologia. La struttura di questa regione e’ strettamente collegata alla funzione del sistema. (aforismi) Questa struttura viene sottoposta a riarrangiamento genomico I processi che si attivano devono parallelamente essere coordinati con la maturazione dei linfociti Dopo il riarrangiamento della regione variabile e la presentazione dell’anticorpo IgM deve avvenire o meno lo switch, il linfocita deve morire sopravvivere o proliferare e c’e’ un turn over enorme Ai cambiamenti strutturali corrispondono quelli funzionali

24 Figura 1 (non voglio farvi una lezione di immunologia e passiamo alla struttura del locus della catena pesante Ig, crms 14 q32 sub- telomerico) Mappa della catena pesante delle IG Al 5’ ci sono le parti variabili V, poi D e J che servono di collegamento alla regione costante, lo switch isotipico, tramite le regioni S che stanno al 5’ di ogni gene costante, genera l’attacco ad una sequenza costante. Noi parliamo delle regioni costanti che caratterizzano le Ig per la funzione : IgM per la risposta umorale primaria, IgG del sangue e tessuti in generale, IgA mucosa intestinale, IgE risposta allergica, IgD funzione ancora non del tutto chiara. VDJ  cluster della catena pesante delle immunoglobuline

25 Confronto tra i geni che costituiscono il locus IGHC nell’uomo e nel topo UOMO    3’ 5’ LCR-A LCR-  SacII Eag I NaeI 120 Kb130 Kb180 Kb VHVH j 22 33 11 22 44 11  Eag I NaeI Eag I NaeI MluI 350 kb 50 kb LCR-  LCR-B  b  a  3’ 5’ TOPO LCR 

26 Studio della Struttura: clonaggi e sequenziamento Confronti in silicio : omologie di struttura ricerca cloni EST Filogenesi, clonaggio da altre specie della LCR (conservazione) Specie note: topo, ratto, coniglio, cavallo, bovini, primati Conservazione e variazione delle strutture (come cercare mutanti) I polimorfismi (mutazioni nell’uomo) studio di popolazione Associazione dei polimorfismi alle patologie, screening (autoimm.) Studio della variabilita’ dell’ espressione delle Ig Studio della diversa funzionalita’ Studio di espressione dei markers della maturazione Studio della induzione della maturazione e switch in vitro

27 Finalita’ Tutto questo per arrivare a capire la regolazione fine delle Ig La struttura con attivita’cis e’ polimorfica, quanto influenza l’espressione ed il funzionamento del sistema fisiologico e patologico Le attivita’ coinvolte in questo modello sono: a) la regolazione della trascrizione ed altro (globulinemia) b) la proliferazione cellulare (linfomi) c) disregolazione delle interazioni con gli altri sistemi (allergie e malattie autoimmuni) Tanto per fare un esempio: topi knock out per il gene Ras sviluppano autoimmunita’. Cellule epiteliali tumorali possono produrre immunoglobuline attivando sistemi che non le sono specifici. Attraverso interazioni si puo’ arrivare a modificare una attivita’ che e’ strettamente collegata con il differenziamento di un altro “tessuto”. Cadono dei dogmi. !!! Si parte sempre da cellule staminali ????


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