Di Sandro Annese.

Presentazione sul tema: "Di Sandro Annese."— Transcript della presentazione:

1 di Sandro Annese

2 DEFINIZIONE HGT Trasferimento di materiale genetico tra due organismi che non sono sessualmente compatibili, fra cui cioè non si può avere produzione di prole mediante riproduzione sessuale. Distinto dal trasferimento genetico verticale (VGF) che riguarda specie sessualmente compatibili.

3 Flusso genico orizzontale in natura
TRA PROCARIOTI TRA EUCARIOTI mediante virus trasformazione o coniugazione TRA PROCARIOTI ED EUCARIOTI coniugazione (Agrobacterium) trasformazione NEI VIRUS infezione

4 SOSTIENE “A Transfer of the antibiotic resistance from plant to bacteria is possible. The probability of such a transfer has previously been underestimated.” Per non riscontrare problemi nel trattamento di patogeni resistenti ad antibiotici CHIEDE: di proibire la manipolazione genetica con geni che conferiscono la resistenza ad antibiotici di non rilasciare nell’ambiente OGM

5 Monitoring field releases of genetically modified sugar beets for
FEMS Microbiology Ecology 28 (1999) 261^272 Monitoring field releases of genetically modified sugar beets for persistence of transgenic plant DNA and horizontal gene transfer Frank Gebhard, Kornelia Smalla OBIETTIVI seguire la persistenza di DNA transgenico da barbabietole. riscontrare, eventualmente, trasferimento orizzontale del gene nptII nella popolazione batterica presente nel suolo. TECNICHE MOLECOLARI PCR ibridazione (DNA probes) CONDIZIONI campo aperto e naturali.

6 PRIMER DESIGN PCR primer systems
Region Primer sequence Size (bp) tannealing (³C) (I) TR2/nptII P-GCATTCCGTTCTTGCTGTA-3P 5P-GATGTTTCGCTTGGTGGTC-3P (II) bar/TR P-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGA-3P 5P-TCGTTTATTTCGGCGTGTAG-3P (III) 35S/BNYVV cp 5P-TGACGCACAATCCCACTATC-3P 5P-CAGCAAGACTAACGGTAAGC-3P

7 Condizioni SUOLO 15,1% sabbia 65,3 % limo
19,7 % argilla 1,6 % carbonio organico pH 6,3 I minerali assorbono sulla superficie il DNA proteggendolo dall’attacco delle nucleasi, inoltre, il DNA mantiene la sua capacità di trasformazione. BATTERI Competenti In particolari condizioni di laboratorio, partendo da DNA purificato o grezzo si può trasformare Acinetobacter con una frequenza di 5x10-9 e rispettivamente.

8 Campionamento e trattamento
Ottobre 1993 semina barbabietole Raccolta campioni (30x1,8 cm) 1994 e 1995 primavera e autunno Essiccati 28 campioni Omogenizzati Risospesi (1gr/9 ml) Setacciati (4 mm) Diluizione 1/10 Semina su LB con Km a[ ] diverse (0,…100 μg/ml) e cicloesamide (100 μg/ml) Crescita a 28°C 2-4 gg Ibridazione colonie singole Conta CFU PCR

9 Monitoraggio popolazione batterica Kmr
I batteri presenti nel suolo presentano diversi livelli di resistenza: alta resistenza 0,6%-5,2% bassa resistenza 4%-30% 4000 colonie singole Ibridazione PCR NESSUN AMPLIFICATO

10 Rivelamento DNA transgenico nel suolo
Estrazione PCR Southern Giovani barbabietole Dopo 6 mesi + -

11 Esperimenti di microcosmo Estrazione totale DNA dal
Aggiunta di DNA transgenico nel suolo Estrazione totale DNA dal suolo e PCR 1h 7g 10g 15g 18g 23g 30g - 5h 1g 2g 4g + SUOLO TR2/nptII (A) bar/TR1 (B) 35S/BNVV cp (C) Sembra esserci un calo sequenziale di DNA nei primi giorni, successivamente la presenza di DNA transgenico sembra rimanere costante o addirittura aumentare.

12 Semina batterica dal suolo DNasi I ed estrazione DNA
Aggiunta di DNA transgenico nel suolo Semina batterica dal suolo su piastre PCA Coltura batterica (dil.10-2/10-3) x 4gg DNasi I ed estrazione DNA PCR 35S/BNYVV cp (C) 1g 4 7 10 15 18 23 30 - + 2 bar/TR1 (A) TR2/nptII (B) suolo I segnali positivi potrebbero indicare l’uptake di DNA transgenico da parte di batteri competenti.

13 Riassumendo Non è stato rilevato alcun segnale di PCR nei campioni di batteri coltivati su terreno selettivo (campioni prelevati dal suolo su cui sono state coltivate le barbabietole OGM). Il DNA transgenico è rilevabile tramite PCR per alcuni mesi. La coltivazione di barbabietole OGM sembra aumentare le CFU dei batteri totali e Kanr. Gli esperimenti di microcosmo segnalano la presenza di DNA transgenico nel DNA estratto da batteri presenti nel suolo; purtroppo non disponendo né del DNA né del ceppo batterico isolato non può essere ritenuto un risultato attendibile per il trasferimento genico orizzontale.

14 Nature Biotechnology 22, (2004) Assessing the survival of transgenic plant DNA in the human gastrointestinal tract Trudy Netherwood, Susana M Martín-Orúe, Anthony G O'Donnell, Sally Gockling, Julia Graham, John C Mathers & Harry J Gilbert  OBIETTIVI Monitorare la presenza del transgene (epsps) lungo il tratto gastrointestinale. Rilevare la presenza del transgene nella microflora intestinale e negli enterociti. TECNICHE MOLECOLARI QC-PCR e PCR

15 Introduzione Il trasferimento genico da piante a batteri competenti è stato osservato, sequenze di DNA cloroplastico sono state trovate in tessuti di pollo e in linfociti di mucche alimentate con mais GM o non GM. Il DNA di alcuni batteriofagi introdotto nell’intestino di topo è stato rilevato in alcuni tessuti del corpo. Il DNA plasmidico esposto alla saliva di mammifero conserva la capacità di trasformazione di S. gordonii e E. coli . Il trasferimento genico richiede la sopravvivenza del DNA nel tratto gastrointestinale, a tal proposito: un transgene (bla codificante una β-lattamasi) inserito in mais è completamente degradato dopo 1 minuto nel liquido gastrico, ma il transgene è rilevabile per almeno 1 ora nella saliva ovina. Nei polli alimentati con lo stesso mais il transgene è presente nello stomaco ma è assente nell’intestino tenue e nelle feci. Studi in vitro che simulano lo stomaco e l’intestino tenue dei mammiferi mostra che il 4 % del transgene non è degradato. Tutto il DNA è degradato nel colon.

16 Presenza del DNA in individui ileostomizzati
7 individui alimentati con pasti contenenti soia GM PCR e QC PCR per rilevare e quantificare presenza del gene epsps Il pasto contiene 3x1012 copie del transgene CaMV 35S epsps NOS Primer RR05 (5’-TGCGGGCCGGCTGCTTGCA-3’) Primer RR04 (5’-CCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGT-3’)

17 Risultati Campione 1 a t=0 C. 4 a t=0 Microflora C. 1 (LB)
Il campione 3 non mostra alcun amplificato nei vari tempi a differenza degli altri.

18 QC PCR Line a = C. 5 a t=180’ Line b = C. 5 a t=210’ 1a. 1x104 copie di pBNS2.2 2a. 2x103 copie di pBNS2.2 3a. 4X102 copie di pBNS2.2 4a. 8X10 copie di pBNS2.2 1b. 1x104 copie di pBNS2.2 2b. 2x103 copie di pBNS2.2 3b. 4X102 copie di pBNS2.2 4b. 8X10 copie di pBNS2.2 17. C. 7 a t=180’ 18. C. 4 a t=180’ 19. C. 4 a t=210’ 20. C. 7 a t=210’ 21. C. 7 a t=150’ 22. C. 6 a t=270’ 23. C. 6 a t=300’ 24. C. 4 a t=240’

19 Rilevamento del transgene epsps e marker interno
Quantità totale del transgene e del marker rilevati dopo 6 ore dalla consumazione del pasto. Rilevamento del marker (indigeribile) nel tempo.

20 Rilevamento del transgene nell’intestino tenue di individui ileostomizzati
Tabella 1 Per determinare se i segnali di amplificazione erano dovuti al rilevamento dell’intera ORF, sono stati utilizzati opportuni primer per amplificare l’intera ORF. Risultato: Il gene intero era rilevato in campioni che contenevano almeno 104 copie del frammento (180 pb) per mg di digerito fresco.

21 Digestione del transgene e il gene della lecitina Le1 (nativo)
La persistenza del gene Le1 e epsps è simile Sono degradati nella medesima quantità

22 Influenza del PEG 4000 sulla attività delle DNasi
Senza PEG 4000 Con PEG 4000 (4%) 1 = 0’ 2 = 5’ 3 = 10’ 4 = 15’ 5 = 22’ 6 = 30’ 7 = 40’ 8 = 60’ La presenza di PEG 4000 sembra aumentare leggermente la quantità di DNA degradato

23 Preesistenza del gene epsps nella flora intestinale
Per accertare l’assenza del transgene prima dell’inizio degli esperimenti, una parte del digerito prelevato dagli individui ileostomizzati è stato trattato per raccogliere e seminare la microflora presente in terreno LB. Crescita fino ad una densità di 108/ml PCR Tabella 2

24 Risultato Le popolazioni batteriche dei volontari ileostomizzati 1, 4, 6 mostravano un debole amplificato della taglia molecolare attesa Il DNA transgenico è stato quantificato: 1-3 copie per 106 batteri La sequenza del transgene è identica a quella utilizzata nella soia GM Non è stato però riscontrata la presenza del gene Le1 Quindi: queste persone probabilmente hanno mangiato soia GM

25 Presenza del DNA nell’intero tratto gastrointestinale
12 volontari sono stati sottoposti ad una dieta con pasti a base di soia GM. La presenza del transgene è stata valutata tramite PCR nelle feci. Nessun amplificato è stato rilevato! Mentre il marker (PEG 4000) è stato rilevato in tutti i campioni (90-98%). Questo significa che il transgene epsps è rilevabile fino all’intestino tenue ed è completamente degradato nell’intestino crasso.

26 Riassumendo Un piccolo tratto del gene epsps oltrepassa indenne lo stomaco e l’intestino tenue di tutti gli ileostomizzati. Fa eccezione l’individuo 3 in cui non è rilevabile la presenza del transgene e il recupero del marker PEG 4000 è basso suggerendo un tempo di transito molto lento. La quantità di porzione di transgene negli altri individui ileostomizzati non è correlabile alla quantità di PEG 4000 suggerendo altri fattori di variabilità oltre il tempo di transito come una differenza di acidità nello stomaco o una diversa quantità di DNasi secreta dal pancreas. I risultati ottenuti sono in contrasto con quelli fatti sui polli, dove il transgene è degradato completamente prima di entrare nell’intestino tenue. Questo riflette probabilmente le differenze fisiologiche tra i 2 organismi. Il transgene è completamente degradato nell’intestino crasso.

27 Nature biotechnology Monitoring and modelling horizontal gene tranfer K. M. Nielsen e J. P. Townsend
OBIETTIVO Proporre un nuovo metodo di monitoraggio del trasferimento genico orizzontale. La review prende in considerazione alcuni aspetti sul 1° articolo citato: una minoranza dei batteri del suolo presenta resistenza intrinseca alla kanamicina, e da 1 g di suolo si arriva ad ottenere circa colonie batteriche resistenti all’antibiotico. L’alta prevalenza numerica di questi rispetto un potenziale e raro evento di trasferimento genico orizzontale del transgene porta ad una veloce saturazione di ogni possibile screening basato sulla coltura batterica. Ne consegue che un osservazione del numero di CFU di batteri Kanr non può essere indicativo di un possibile trasferimento orizzontale. Sono state analizzate 4000 colonie Kanr cioè quelle presenti in 0,4 g di suolo, cioè approssimativamente 1 dei batteri Kanr coltivabili.

28 Ponendo una frequenza di evento HGT di (in condizioni naturali) bisognerebbe isolare i batteri coltivabili in terreno selettivo provenienti da 100 g di suolo. Questo significa utilizzare 3000 piastre di agar! La quantità di DNA totale usata per la PCR è stata di circa 400 ng, cioè circa 2,5 x 107 genomi batterici ma, per avere un amplificato bisogna avere almeno 50 copie del transgene per reazione, o almeno un trasformante batterico su 5x105. Inoltre, quando si estrae il DNA direttamente dal suolo bisogna tener conto delle deviazioni derivanti dall’estrazione di DNA anche fungino (la maggior parte dei microrganismi presenti sono funghi), che può abbassare la sensibilità della reazione di PCR. QUINDI: tenendo presente che il materiale analizzato non supera i 2 grammi, questo studio si rileva insufficiente per determinare la frequenza di HGT in condizioni naturali.

29 Sul secondo articolo gli autori si soffermano sulle reazioni di PCR della microflora intestinale negli individui ileostomizzati, dove 3 campioni su 7 risultavano positivi prima degli esperimenti. Il campione di DNA analizzato è stato di 1 μg cioè circa 6,3x107 genomi. Almeno 80 copie del transgene sono necessarie per l’amplificazione. I segnali di amplificazione assumono un alta frequenza di HGT cioè di 1 su 7,9x105 batteri. Il disegno sperimentale è limitato dalle subcolture cellulari, si prelevano i batteri da 0,5 grammi di campione e si fanno oltre 7 round di diluizioni e arricchimenti in LB. Così durante la crescita competitiva in vitro, le specie batteriche presenti in misura inferiore tendono a scomparire (il campione iniziale è diluito 1016 volte). Questo fa concludere che il sistema di arricchimento della coltura batterica (100 generazioni), non può essere considerato un buon modello sperimentale perché presuppone la presenza nel campione iniziale di almeno 1 trasformante su 5x105 batteri coltivabili in vitro (10%). Tenendo presente ambedue gli studi prima esplicati: Se solo il 10 % dei batteri è coltivabile, assumendo una densità batterica di 108 cellule per grammo di campione è stato analizzato solo lo 0,004% della popolazione batterica.

30 Modello sperimentale: l’effetto della selezione sui trasformanti
I modelli sperimentali in questi studi hanno preso in maniera implicita la possibilità di rilevare i trasformanti durante la prima generazione. Non hanno tenuto conto dell’esposizione del transgene in funzione della dinamica di crescita batterica. In condizioni naturali (scarsi nutrienti), una vasta popolazione batterica può aver bisogno anche di anni per essere competente alla trasformazione e rilevabile attraverso PCR. Sicuramente un vantaggio selettivo dovuto al transgene porta ad un aumento della popolazione batterica trasformante con il tempo, fino alla fissazione del carattere. Sarebbe più opportuno applicare, secondo gli autori, un modello di crescita batterica di tipo deterministico, assumendo un singolo evento di HGT e che il transgene sia in via di fissazione.

31 Per l’espansione del transgene successivamente all’evento di HGT:
Immediatamente dopo il singolo evento di HGT la frequenza del transgene in una popolazione aploide è 1/N dove N è il numero di individui nella popolazione di interesse. Per l’espansione del transgene successivamente all’evento di HGT: P= emt/ (N-1 + emt) Questa formula è stata utilizzata per generare il seguente grafico. Rappresenta il tempo di fissazione (durante le generazioni) di un singolo evento di HGT in una popolazione di 1010 (N). I coefficienti di selezione (da sinistra a destra) sono 0.05, 0.01, 0.005, e Il tempo di generazione batterica in condizioni naturali va da meno di un ora a settimane o anche di più. Assumendo un tempo di generazione di 30’ l’ascissa va dalle 6 ore ai 6 anni. Assumendo un tempo di generazione di 1 settimana l’ascissa va da 20 ore a 2000 anni.

32 Rilevamento HGT: quantità del campione e tempo di rilevamento
La probabilità di rilevare un raro evento di HGT in una vasta popolazione batterica dipende dalla quantità del campione (n), dove per n si intende il numero di batteri esaminati in possesso del transgene. Se la frequenza di un transgene in una popolazione è p, la probabilità di rilevarlo è 1-(1-p)n. Nella seguente figura si mostra il numero di campioni necessari per rilevare un evento di HGT (selezione positiva) con il 95% di probabilità, partendo da 1010 batteri. La probabilità aumenta con il tempo (generazioni). Coefficienti di selezione (x) da sinistra a destra: 0.1, 0.01, e Chiaramente una forte selezione positiva sul transgene riduce sia il tempo necessario che il numero di batteri.

33 Probabilità di rilevare HGT con un campioni di 5000 batteri
Coefficienti di selezione (x) da sinistra a destra: 0.1, 0.01, 0.001, Come possiamo notare, al diminuire del coefficiente di selezione aumenta il tempo necessario affinchè il transgene si fissi nella popolazione batterica.

34 Probabilità di rilevare HGT con un campioni di 5000 batteri dopo 1000 generazioni (dall’evento)
Coefficienti di selezione 0.016, e La probabilità di rilevamento aumenta in maniera proporzionale al numero di cellule di partenza e all’aumentare del coefficiente di selezione.

35 Concludendo Secondo gli autori:
il trasferimento genico orizzontale è un evento talmente raro che anche in futuro sarà difficile rilevare la sua avvenuta, questo perché la sola trasformazione batterica non basta, c’è bisogno della fissazione del carattere che può consistere in molte generazioni (anni); il transgene se non conferisce alcun vantaggio selettivo può essere perso o non funzionare a causa di una mutazione, delezione o inserzione; perciò, sostengono la tesi che per studiare i possibili effetti dell’ HGT, c’è bisogno di individuare un transgene che conferisca una selezione positiva al ceppo batterico in un ambiente complesso come quello del suolo dove anche le variazioni temporali e spaziali hanno influenza. Molti transgeni sono presenti nel suolo naturalmente (geni batterici) come epsps. Con la tecnologia ricombinante nuovi vettori e cassette di espressione sono progettate con la finalità di produrre vaccini, farmaci, fine chemicals: possono questi geni avere effetti positivi sulla selezione in un ambiente naturale?

36 Bibliografia K. M. Nielsen e J. P. Townsend. Monitoring and modelling horizontal gene transfer. Nature biotechnology (2004). J. Conner, T. R. Glare e J. P. Nap. The release of genetically modified crops into the environment, part II. Overview of ecological risk assessment. Plant J (2003). K. M. Nielsen, A. Bones, K. Smalla, Van Elsas. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria-a rare event? FEMS Microbiol. Rev. 22, (1998). M. T. Ceccherini et al. Degradation and trasformability of DNA from transgenic leaves. Appl. Environ. Microbiol. 69, (2003). F. Gebhard e K. Smalla. Monitoring field releases of genetically modified sugar eets for persistance of transgenic plant DNA and horizontal gene transfer. FEMS Microbiol. Ecol. 28, (1999). T. Netherwood et al Assessing the survival of trangenic plant DNA in the human gastrointestinal tract. Nature biotechnology 22, (2004). K. M. Nielsen, Van Elsas, K. Smalla. Trasformation of Ainobacter sp. BD413(pFG4ΔnptII) with transgenic plant DNA in soil microcosms and effects of kanamycin on selection of trasformants. Appl. Environ. Microbiol. 66, (2000).