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ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE Quantizzazione delle proteine Applicazioni delle proteine di fusione.

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Presentazione sul tema: "ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE Quantizzazione delle proteine Applicazioni delle proteine di fusione."— Transcript della presentazione:

1 ESERCITAZIONI 2008 APPLICAZIONI DI GENETICA UMANA E MOLECOLARE Quantizzazione delle proteine Applicazioni delle proteine di fusione

2 Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine Il legame del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976) da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) in soluzioni acide (Bradford, 1976)

3 Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford Tale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der WaalsTale colorante forma forti complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi aminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals Il colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforicoIl colorante è preparato come soluzione stock in acido fosforico Il metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina lassorbanza a 595 nmIl metodo è un semplice procedimento costituito da un unico passaggio in cui il colorante è aggiunto ai campioni e si determina lassorbanza a 595 nm La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto lintensità del colore blu (e dunque lassorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteinaLa quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina presente in soluzione, pertanto lintensità del colore blu (e dunque lassorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante il saggio è indipendente dal tipo di proteina

4 VANTAGGI Semplicità di preparazione del reattivo Sviluppo del colore immediato Stabilità del complesso Elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) Il saggio è compatibile con la maggior parte dei tamponi comuni,degli agenti denaturanti come guanidina·HCl 6M e urea 8 M e dei preservanti come sodio azideSVANTAGGI Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere La quantità di colorante che si lega alla proteina dipende dal contenuto in aminoacidi basici ciò rende difficile la scelta di uno standard Molte proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida Quantizzazione delle proteine tramite reattivo di Bradford

5 Saggi di Pull-Down Doppio Ibrido Saggi di legame APPLICAZIONI DELLE PROTEINE DI FUSIONE

6 Pull-Down Tecnica per verificare interazioni proteina-proteina sospette ESCA Proteina di fusione PREDA Proteina dinteresse (eucariotica)

7 Pull-Down Produrre la proteine di fusione (ex: GST-proteina) Purificare la proteina di fusione (ex: GST-Resina Glutatione) Controllare su gel di poliacrilammide la qualità della purificazione Preparare gli estratti cellulari eucariotici che contengono la proteina dinteresse

8 Preda Pull-Down ESPERIMENTO CONTROLLO GST Esca Resina Estratto cellulare Preda X lavaggi GST Esca Resina X GST Resina Estratto cellulare Preda X lavaggi X GST Resina Preda J Y Z J Y Z Z Z

9 Pull-Down Verifica dellinterazione tramite SDS-Page Western Blot SDS-PAGE TRASFERIMENTO WESTERN BLOT BLOCKINGANTICORPO PRIMARIO ANTICORPO SECONDARIO SVILUPPO

10 Pull-Down Verifica dellinterazione tramite SDS-Page Western Blot MK INPUT CO ESP La nostra proteina dinteresse è stata legata dalla proteina di fusione! Il controllo è pulito

11 Pull-Down LIMITI DEL SAGGIO: Necessità di controlli negativi, presenza di legami aspecifici alla resina. Interazioni deboli o transienti potrebbero non essere rilevate. La presenza del tag potrebbe interferire con il legame. E un sistema forzato che potrebbe non rispecchiare leffettiva situazione biologica.

12 Sistema del Doppio Ibrido Con questa tecnica è possibile individuare interazioni proteina- proteina. Si basa sulla proprietà dei fattori di trascrizione di essere organizzati funzionalmente in domini distinti 1)Il dominio legante il DNA (DBD) 2)Il dominio di transattivazione (AD)

13 I domini proteici sono normalmente identificati a classificati in base alle loro caratteristiche strutturali, funzionali e legate allevoluzione. Un dominio può quindi essere descritto come ununità strutturale foldata, compatta e autonoma, conservata durante levoluzione e in grado di funzionare indipendentemente dal contesto a cui appartiene la proteina. Sistema del Doppio Ibrido

14 Sperimentalmente è quindi possibile scindere due domini di una proteina che singolarmente non funzionerebbero, e fare in modo che riaquistino la loro funzionalità rincontrandosi. Sistema del Doppio Ibrido AD DB AD DB AD DB

15 Sistema del Doppio Ibrido Tra i fattori di trascrizione più utilizzati cè GAL4, che legando il promotore di Lacz permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in grado di scinderla e le colonie che hanno integrato il plasmide si colorano di blu. Lacz Gal4 β-galattosidasi X-Gal UAS

16 Creazione di due ibridi: DBD Hybrid: costituito dal dominio DBD fuso alla proteina dinteresse (Esca). Questa proteina di fusione può legare il DNA, ma non è in grado di attivare la trascrizione. AD Hybrid: costituito dal dominio AD fuso ad unaltra proteina (Preda). Normalmente viene utilizzata una libreria di DNA. Sistema del Doppio Ibrido

17

18 Peptide Microarray

19 High signal intensity Low signal intensity Positive data setNegative data set


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