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Clonaggio PCR Amplificazione DNA. Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali.

Copie: 1
Editing dellRNA. Editing dellmRNA per la Apolipoproteina B umana.

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Presentazione sul tema: "Clonaggio PCR Amplificazione DNA. Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali."— Transcript della presentazione:

1 Clonaggio PCR Amplificazione DNA

2 Vettori di clonaggio Plasmidi Virus Trasposoni Minicromosomi artificiali

3 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

4

5 sito di restrizione

6 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

7 Gli enzimi di restrizione possono generare diversi tipi di estremità

8 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

9 Uso degli enzimi di restrizione Clonaggio Mappa di restrizione Polimorfismi di restrizione (RFLP)

10 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

11 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

12 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

13 Vettori plasmidici

14 1.Origine di replicazione 2.Marcatore di selezione 3.Sito di restrizione unico Elementi di un vettore plasmidico

15 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

16 Preparazione del DNA da clonare Frammento di DNA genomico che può contenere regioni trascritte o non trascritte cDNA: DNA ottenuto per trascrizione inversa dellmRNA, che quindi contiene tutto o parte di una regione trascritta frammentato con enzimi di restriz. frammentazione meccanica DNA specifico Collezione DNA (banca, genoteca) Digestione clone già esistente PCR

17 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

18 PREPARAZIONE del cDNA RNA DNA

19 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

20 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO

21 Unione, mediante ligasi, di estremità coesive create da un enzima di restrizione GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi GAATTC CTTAAG VETTORE G CTTAA AATTC G INSERTO

22 strategie controlli Reazione di ligasi

23 Inserzione di un frammento di DNA in un vettore circolare mediante ligasi di estremità coesive GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G CTTAA AATTC G EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G CTTAA EcoRI VETTORE INSERTO

24 trattamento del vettore con fosfatasi G CTTAAp pAATTC G G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG Clonaggio con singola digestione

25 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

26 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

27 Introduzione del DNA nella cellula ospite Trasformazione: CaCl2 Impacchettamento e infezione fagica In E.coli Elettroporazione In cellule di eucarioti superiori Trasfezione (transiente o stabile): Calcio fosfato Liposomi Elettroporazione Microiniezione DNA gun

28 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

29 Vettori plasmidici

30 Strategie di selezione nel clonaggio AMPICILLINA resistenza

31 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Scelta e preparazione del vettore Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Analisi dei prodotti

32 1200 bp SacI EcoRI

33 1.lisi cellulare 2.deproteinizzazione 3.concentrazione Isolamento acidi nucleici

34 Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa) Analisi acidi nucleici

35 Spettro di assorbimento del DNA lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

36 Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

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38 Elettroforesi su gel di agarosio

39 Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

40 Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

41 Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

42 Visualizzazione del DNA

43 Marcatori di peso molecolare HindIII

44

45 Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

46 BLOTTING (TRASFERIMENTO) Molecole trasferite SondaGel SouthernDNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide NorthernRNA DNA o RNA Agarosio o acrilammide WesternProteineAnticorpi Acrilammide

47 Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

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49 carta 3MM membrana nylon gel supporto } carta 3MM tampone vaschetta Assemblaggio del blot capillare

50

51 Fattori che influenzano libridazione Temperatura Forza ionica pH

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