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DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO.

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Presentazione sul tema: "DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO."— Transcript della presentazione:

1 DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

2 Il clonaggio del DNA Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita di DNA capace di replicarsi detto vettore). Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall Escherichia coli). Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita praticamente illimitate

3 Plasmidi Molecole extracromosomiali di DNA circolare, capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale dei batteri. Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.) Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che non sia troppo grande) Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale in grande quantità.

4 Plasmidi

5 Plasmidi: Superavvolgimento M Non digerito Digerito

6 Il DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi Plasmide (P) DNA genomico (G) 3 x 10 9 basi Eco RI (E) Eco RI M Bam HI (B) PP+BP+EG+E 10 kb + -

7 MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA 6.6 bp PstI HindIII 1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb PstIHindIII M ,5 PstI+HindIII

8 Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti con estremità libere

9 DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sono adiacenti, vengono uniti in provetta. Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la tecnica del DNA ricombinante. I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione. GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoRI G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G

10 G CTTAA AATTC G GAATTC CTTAAG Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi.

11 GAATTC CTTAAG DNA LIGASI ATP 5 3 G CTTAA OH P AATTC G OH P 5 3 G AATTC CTTAA G 5 3 OHP P G AATTC CTTAA G OH P P Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA

12 Solo estremità compatibili possono essere legate efficientemente

13 INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

14 CLONAGGIO: - LIGASI - TRASFORMAZIONE - SELEZIONE - CRESCITA COLONIE

15 IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

16 Cosa può succedere in una reazione ligasica ? 1.Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con linserto 2.Il vettore si lega con linserto

17 Lenzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare le colonie che contengono un plasmide con inserto da quelle che contengono un plasmide senza inserto

18 ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA TRONCHE (BLUNT) ESTREMITA BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA BLUNT PRODOTTE DA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLA COMPLEMENTARIETA DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE. SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA BLUNT E MENO EFFICIENTE PECHE NON SI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO. CCC/GGG GGG/CCC GAT/ATC CTA/TAG SmaI EcoRV CCC GGG ATC TAG LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEI DUE ENZIMI.

19 QUANDO E NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA INCOMPATIBILI???? E POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA STICKY IN ESTREMITA BLUNT Estremita 5 protruding : Lestremità 3 del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI. Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli (DNA POLIMERERASI intera ha azione 5esonucleasica ). Estremità 5 o 3 protruding: Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.

20 Il fago lambda come vettore di clonaggio

21 Il ciclo vitale del fago lambda

22 Placche di lisi

23 Lisogenia

24

25 Ricombinazione sito-specifica

26 Ricombinazione omologa

27 INFEZIONE Produzione di enzimi Per la sintesi del DNA Inizia la replicazione Produzione di teste e code del fago packaging lisi FASE PRECOCE FASE TARDIVA Ciclo litico

28 Un interruttore complesso

29

30 Replicazione rolling circle COS Genoma COS Genoma COS Genoma COS Packaging

31 Il fago lambda come vettore

32 VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb VETTORI di inserzione -> 0-10 kb VETTORI di sostituzione-> 9-23 kb VETTORI COSMIDICI-> kb VETTORI PAC (crom. artif. P1)-> kb VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb VETTORI YAC (crom. artif.lievito)-> Mb Dimensione degli inserti contenuti nei principali vettori

33 Cosmidi

34 P1

35 YAC


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