La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La regolazione dellespressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "La regolazione dellespressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima."— Transcript della presentazione:

1 La regolazione dellespressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva in ogni cellula; per esempio, in una cellula delle isole del pancreas è attivo il gene per linsulina, non quelli per lemoglobina (attivi nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle cellule della mucosa gastrica) Durante lo sviluppo embrionale di un organismo multicellulare, le cellule destinate a costituire i diversi tessuti e organi attivano in momenti precisi i geni che codificano le proteine che stimolano o inibiscono la proliferazione cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in formazione (per esempio osseina per le ossa, cheratina per la pelle) Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di attivare alcuni geni solo in particolari circostanze (per esempio la presenza di un nutrimento che richiede particolari enzimi) per non sprecare lenergia e le molecole necessarie Le cellule tumorali hanno perduto, anche in seguito a mutazioni somatiche, la capacità di regolare lespressione genica relativa alle proteine che controllano la proliferazione cellulare Lesempio che viene proposto nelle diapositive 2-5 riguarda la regolazione dellattività dei geni (detta espressione genica) relativa agli enzimi per il metabolismo del galattosio in Escheirichia coli (sistema lac) Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere recettori in grado di percepire segnali provenienti dallambiente esterno e veicolati allinterno della cellula; tali recettori devono quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in funzione dei segnali provenienti dallesterno

2 Il sistema lac in E. coli O C1C1 C5C5 C2C2 C3C3 HOC 6 H 2 C4C4 OHH H HH H H H O O C1C1 C5C5 C2C2 C3C3 HOC 6 H 2 C4C4 OHH H H O C1C1 C5C5 C2C2 C3C3 HOC 6 H 2 C4C4 OH H H H HH O C1C1 C5C5 C2C2 C3C3 HOC 6 H 2 C4C4 OHH H H H H Lattosio + H 2 O -galattosidasi Galattosio Glucosio Lenzima -galattosidasi, che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia, viene sintetizzato in presenza di lattosio che quindi oltre che esserne il substrato è anche linduttore della sua sintesi Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2 enzimi: permeasi e transacetilasi; anche la permeasi è coinvolta nel metabolismo del lattosio, poiché facilita lingresso del lattosio nella cellula.

3 I geni strutturali e il gene I transacetilasi -galattosidasi permeasi ZYA Un unico mRNA policistronico trascrizione traduzione F(lac) I I + = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dellinduttore; I - = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre; I s = allele inibente la risposta allinduttore: Z, Y, A non trascrivono mai Merodiploidi per definire le relazioni funzionali tra gli alleli I + Z - /I - Z + Trascrive* con linduttore I - Z - /I + Z + Trascrive* con linduttore I - Z - /I - Z + Trascrive* sempre I s Z + /I + Z + Non trascrive mai I s Z + /I - Z + Non trascrive mai 1) I s è dominante su I + che a sua volta è dominante su I - 2) I + è dominante su I - indipendentemente dalla posizione in cis o in trans rispetto a Z + Geni lac *un mRNA per un enzima funzionale

4 Operatore, promotore e operone O + Z + /O c Z + Trascrive* sempre O + Z + /O c Z - Trascrive* con linduttore O + Z - /O c Z + Trascrive* sempre I s O + Z + /I + O c Z + Trascrive* sempre O + = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dellinduttore; O c = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre ZYAO 1) O c è dominante su O +, ma solo in cis rispetto a Z + (cis-dominanza) P 2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui mutanti difettivi di P, che impediscono incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A, impedendo linserimento della RNA polimerasi I operone Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile che, in assenza dellinduttore, si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y, A; in presenza dellinduttore non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A *un mRNA per un enzima funzionale

5 Regolazione dellespressione genica nelloperone lac ZYAOPI RNA polimerasi repressore non legato allinduttore, che si lega ad O e impedisce la trascrizione induttore repressore legato allinduttore, che non si lega ad O e non impedisce la trascrizione repressore I - senza affinità per O, con cui non si lega mai e non impedisce mai la trascrizione repressore I s senza affinità per linduttore, che si lega sempre ad O e impedisce sempre la trascrizione mRNA ZYAOPI I-I- IsIs ZYAOPI ZYAOPI OcOc P-P- operatore senza affinità per il repressore che non lega mai e non impedisce mai la trascrizione promotore senza affinità per lRNA polimerasi che impedisce sempre la trascrizione ZYAOPI

6 Ingegneria genetica Batterio Cromosoma batterico Plasmide DNA ricombinante (plasmide) Batterio ricombinante duplicazione Inserimento del plasmide nella cellula batterica Le tecniche dellingegneria genetica permettono di isolare un gene che codifica per una determinata proteina e di inserirlo, mediante dei vettori adatti, nel genoma di un altro organismo. Queste tecniche sono state applicate al campo della medicina per la produzione farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche, per la progettazione di vaccini. In agricoltura si stanno progettando piante e animali transgenici, per aumentarne la produttività e migliorarne la qualità. Ma tutto ciò pone problemi nuovi di carattere etico, economico, biologico che devono essere attentamente valutati per la tutela della vita e dellambiente. Copie delle proteine come ad esempio insulina, ormone della crescita Copie del gene isolato Cellula contenente il gene da isolare Plasmide isolatoDNA purificato Gene da isolare

7 Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi capaci di tagliare il DNA producendo rotture a doppia elica in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (siti di restrizione); di essi si servono i batteri per distruggere i cromosomi virali EcoRI HaeIII AATTC endonucleasi G CTTAAG Sito di restrizione Tipo di taglio Sfalsato, adesivo CC GG Tronco, non adesivo I siti di restrizione sono brevi sequenze palindromiche: la sequenza posta a un lato rispetto al centro del sito è complementare alla sequenza inversa rispetto a quella posta al lato opposto Formazione di code CC GG 5353 CC GGAA TT Si possono aggiungere al 3 di uno dei 2 filamenti di un capo di un taglio tronco, non adesivo, una breve sequenza, ripetizione di un solo nucleotide e al 3 dellaltro capo la sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio Un taglio è detto adesivo quando: 1)È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3; 2)I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o aggiunti, sono fra loro complementari Le estremità di un taglio adesivo si possono unire mediante i legami idrogeno tra le basi complementari presenti a singolo filamento sui 2 segmenti di DNA; successivamente, mediante lazione di ligasi e, se serve, di DNA polimerasi, si saldano i filamenti polinucleotidici (vedere diapositiva 8)

8 Mappe di restrizione 1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con 32 P al 5 2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi di restrizione 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso su un gel mediante elettroforesi Una mappa di restrizione consiste nellidentificazione della successione dei siti di restrizione per diverse endonucleasi in un segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti come numero di nucleotidi Lelettroforesi consiste nel collocare le macromolecole in un pozzetto allestremità di un gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo elettrico; le molecole si spostano con una velocità proporzionale alla propria carica elettrica e inversamente proporzionale lla propria lunghezza; poiché nel DNA la carica è distribuita uniformemente, la velocità dipende solo dalla lunghezza del frammento Siti di restrizione dellenzima Marcatura con con 32 P

9 Il DNA ricombinante VETTORI Sono cromosomi capaci di replicare e selezionabili, in cui si possono inserire segmenti di DNA di interesse I vettori possono essere : -plasmidi, -cromosomi di fagi, - ibridi fago-plasmide (cosmidi), tutti capaci di replicarsi in E. coli, -YAC, cioè cromosomi artificiali di lievito, capaci di replicarsi in lievito In ogni tipo di vettore si può inserire un frammento di DNA di una particolare lunghezza massima Digestione con endonucleasi Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro uguali Estremità adesive complementari alle precedenti DNA polimerasi I + ligasi vettore DNA da clonare

10 La clonazione del DNA Genoma da saggiare frammentato con enzimi di restrizione Cromosomi di fago frammentati ligasi Genoteca di DNA ricombinante Ibridazione su filtro con sonda radioattiva complementare al DNA da studiare Clonazione Individuazione dei geni clonati: Southern blotting 1) Si effettua lelettroforesi su gel dei frammenti a doppia elica 2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un filtro 3) Si ibridizza con sonda radioattiva complementare al frammento cercato e si effettua lautoradiografia, localizzando così il gene studiato

11 Sequenziamento SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI C 1) Si marca con 32 P lestremità 5 del frammento da analizzare, quindi si denatura il DNA 2) Si distruggono selettivamente basi o loro combinazioni (G, G+A, C, C+T), che rendono più fragile il filamento saggiato, che quindi si rompe in quei punti G A T GG+ACC+T 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso in una corsa elettroforetica

12 Reazione a catena della polimerasi (PCR) PCR Primer 1 Primer 2 Taq polimerasi, resistente al caldo Regione complementare a Si alternano cicli di denaturazione (a temperatura alta) e di replicazione ( a temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un raddoppiamento del numero delle molecole

13 Costruire nuovi geni SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO : è possibile allungare filamenti di DNA al 5 aggiungendo nucleotide dopo nucleotide costruendo oligonucleotidi di sequenza voluta INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE 1) Si rompe il DNA con endonucleasi 2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione 5 con esonucleasi 3) Si modificano specifici nucleotidi sul filamento rimasto; dopo la replicazione, anche il nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito


Scaricare ppt "La regolazione dellespressione genica Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima."

Presentazioni simili


Annunci Google