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- Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici - Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante.

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Presentazione sul tema: "- Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici - Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante."— Transcript della presentazione:

1 - Origine autonoma di replicazione (ORI) - Geni per la selezione: resistenza ad uno o due antibiotici - Altri geni per la selezione del plasmide ricombinante - Siti multiplo di clonaggio CARATTERISTICHE VETTORE PLASMIDICO DI CLONAGGIO

2 T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007 oppure elettroporazione

3 T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007 Piastramento su terreno con antibiotico

4 T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007 Selezione per la presenza del vettore: resistenza ad antibiotico

5 Batteriofago lambda Infezione VETTORI DI CLONAGGIO PER E. coli TipoDimensioni (kb) Dimensioni inserto (kb) Sistema selezione Metodo introduzione Plasmidi pBR322 4,3 6 2 Antibiotici Trasformazione pUC 2,1 8 Amp + Lac Z Trasformazione Fago filamentoso M13 6,4 3 Lac Z Trasfezione Cosmidi Antibiotico Infezione Cromosomi artificiali 7 fino a 300 Amp (CM) + Lac Z Elettroporazione BAC

6 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Plasmide pBR322

7 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 pBR322: screening delle colonie ricombinanti

8 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

9 Vettori plasmidici (pUC18)

10 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Il gene LacZ codifica per il polipeptide β-galattosidasi (1021 a.a.)

11 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Ceppo di E.coli: gene Lac Z mutante: peptide parziale Vettore pUC: gene LacZ mutante: peptide parziale Complementano β-galattosidasi ATTIVA Ceppo di E.coli Lac Z mutante Vettore LacZ interrotto dal clonaggio Non cè complementazione β-galattosidasi INATTIVA Terreno + X-Gal β-galattosidasi ATTIVA β-galattosidasi INATTIVA Metabolizzato Non metabolizzato Colonie Blu Colonie bianche X-Gal: 5-Bromo-4-Cloroindolil-β-galattoside (incolore)

12 (induttore)

13 Metodi di inserimento dei vettori ricombinanti nelle cellule batteriche Trasformazione: plasmidi (DNA) trasformano cellule procariotiche rese competenti Infezione: fagi (DNA con capsidi) che lisano il batterio Trasduzione: cosmidi (DNA con capsidi) che nel batterio si comportano come plasmidi Trasfezione: come una trasformazione ma con DNA fagico senza capsidi per es: per introdurre la forma replicativa di M13 a doppio filamento

14 BATTERIOFAGO LAMBDA COME VETTORE DI CLONAGGIO Lambda w.t. = 50 Kb Estremità cos di 12 nt per circolarizzazione Infezione di E. coli

15 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

16 Batteriofago lambda

17 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Batteriofago lambda Lambda w.t. = 50 Kb Lambda di sostituzione: eliminati geni ciclo lisogenico, inserti fino a 23 Kb Clonaggio di frammenti DNA esogeno e packaging in vitro Infezione

18 T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright © 2007 Formazione di catenani Creati siti unici per clonaggio

19 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Fago difettivo (siti cos alterati) non può replicarsi ma produce proteine per i capsidi che possono essere purificate Fagi difettivi che da soli non producono capsidi. Le singole proteine possono essere purificate

20 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 CLONAGGIO IN BATTERIOFAGI

21 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Screening placche di lisi Infezione fagica

22 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Fago filamentoso La cellula batterica non viene lisata!

23 Fago filamentoso

24 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

25 Clonaggio in cosmidi Formazione di catenani Formazione di colonie

26 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 CROMOSOMI ARTIFICIALI DI BATTERIO (BAC) Fattore di fertilità F di E. coli ha 3 geni (parA, parB, repE) per la replicazione e per mantenere basso il numero di copie del fattore (1- 2 per cellula) Gene per la resistenza al cloramfenicolo (per selezione trasformanti) Siti di clonaggio nel gene LacZ (identificazione ricombinanti per complementazione) Inserto tra 150 e 350 Kb Integrazione batterica per elettroporazione Promotori per la trascrizione (T7 e SP6)

27 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006

28 VETTORI DI CLONAGGIO IN LIEVITO: YAC (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME) Saccharomyces cerevisiae: 16 cromosomi da 250 kb a 2 Mb

29 Griffiths et al., GENETICA 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2006 Inserto: 300 kb – 1 Mb Sferoplasting: liticasi

30 SUP 4 CEN = Centromero ARS = sequenze autonome di replicazione TRP1 e URA3 per selezione di molecole con entrambi i bracci URA 3 = gene per un enzima della sintesi dei nucleotidi pirimidinici TRP1 = gene per un enzima della sintesi del triptofano SUP 4 = gene per il tRNA per la tirosina che sopprime la mutazione non senso ochre nel gene ADE2 del ceppo di lievito ADE2 = gene per la sintesi di adenina: un precursore (fosforibosil amminoimidazolo) che sta a monte nella via biosintetica si accumula e dà colonie rosse S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione ochre. Nel codone UAU (tyr) nel gene ADE2 si verifica la mutazione ochre UAA non senso e diventa ADE2(-): ladenina non viene sintetizzata e si accumula come premetabolita rosso

31 S. cerevisiae (w.t): crescono se nel in terreno cè uracile e triptofano S. cerevisiae (w.t): URA (-), TRP (-), ADE2 (-) per mutazione ochre accumulo di premetabolita delladenina colonie rosse YAC con gene SUP 4 = gene per il tRNA con UAA Tyr* SUP 4 integro sopprime la mutazione non senso ochre nel gene ADE2 del ceppo di lievito: viene sintetizzata adenina, non cè accumulo di premetabolita rosso colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC senza inserto (SUP attivo) colonie bianche S. cerevisiae (terreno minimo) + YAC con inserto (SUP inattivo) colonie rosse

32 VANTAGGI E SVANTAGGI DEL CLONAGGIO IN YAC: - Chimerismo (co-saldatura di più regioni nello stesso YAC) - Instabilità (soprattutto a livello di regioni ripetute) - Co-trasformazione (più di uno YAC per cellula di lievito) Distribuzione dei cloni in griglie Produzione di filtri con i singoli cloni da utilizzare in screening Allineamento dei cloni in contigui

33 ALLINEAMENTO DI YAC PER CONTENUTO DI STS


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