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STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE - Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down)

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Presentazione sul tema: "STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE - Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down)"— Transcript della presentazione:

1 STUDIO FUNZIONALE DI UNA PROTEINA ATTRAVERSO LA SUA INTERAZIONE CON ALTRE PROTEINE - Cromatografia per affinità (saggio in vitro) (es: saggi pull-down) - Phage display (saggio in vivo) - Sistema del doppio ibrido di lievito (saggio in vivo)

2 Un dominio può quindi essere definito come ununità strutturale, con ripiegamenti tridimensionali, che costituisce una unità funzionale autonoma rispetto al resto della proteina, che di solito è evolutivamente conservata I domini proteici vengono di solito identificati e classificati rispetto alle loro caratteristiche strutturali, funzionali ed evolutive. Concetto di dominio proteico

3 Cromatografia per affinità (saggio in vitro) Una certa proteina (esca) viene immobilizzata su una matrice di supporto inerte di una colonna cromatografica nella quale viene fatto passare un lisato cellulare. In genere la proteina esca è fusa con unaltra proteina (attaccata alla matrice solida). Le proteine (prede) che interagiscono con lesca sono trattenute nella colonna, le altre trascinate via. Successiva eluizione aumentando la concentrazione salina del tampone ESCA Proteina di fusione (es: una certa proteina fusa con GST) PREDA Proteina da individuare

4 CROMATOGRAFIA PER AFFINITA (saggio di pull-down)

5 CROMATOGRAFIA PER AFFINITA (pull down) Tag = GST Colonna con Glutatione Analisi della/e proteina: digestione proteolitica e spettrometria di massa Una esca cattura un complesso proteico

6 Phage-display Esibizione di proteine sulla superficie di un batteriofago filamentoso, es: M13 -Fusione di un gene di una proteina di rivestimento del fago con lintero gene (oppure con dominio proteico) di interesse -Trasfezione in E. coli -Espressione della proteina ibrida nel rivestimento del fago

7 COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY - Produzione di fagi ricombinanti ottenuti clonando miscele di cDNA ottenuti da tessuti (librerie di espressione specifiche) - Ogni fago esprime ed esibisce una proteina di interesse fusa con quella fagica

8 COSTRUZIONE DI UNA LIBRERIA DI PHAGE DISPLAY - Per vagliare una proteina di interesse: - immobilizzazione della proteina su particelle in una colonna - immobilizzazione della proteina in pozzetti di piastre da microtitolazione - Ogni fago esprime ed esibisce una proteina di interesse fusa con quella fagica - Mettere a contatto una soluzione con lintera libreria fagica - Lavare - Eluire il fago trattenuto con tampone a determinati pH o forza ionica - Caratterizzare il fago trattenuto in seguito ad infezione batterica

9 Applicazioni del Phage display - studio delle interazioni proteina-proteina - studio delleffetto funzionale di varianti amminoacidiche

10 SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO Lespressione genica in S. cerevisiae dipende da fattori di trascrizione con 2 domini. Dominio di legame al DNA (Binding Domain) o BD Dominio di attivazione della trascrizione (Activation Domain (AD) Sostituzione dei fattori di trascrizione con proteine di fusione (ognuna costituita in parte da un dominio del fattore di trascrizione e in parte dalla proteina campione) Se si verifica interazione tra questa coppia di ibridi si ottiene lespressione del gene bersaglio di lievito Ovvero: proteine che si legano fisicamente luna allaltra vengono individuate grazie alla loro capacità di attivare la trascrizione di un gene indicatore

11 I due vettori ibridi derivanti dal 2 µ selezionati in E. coli, poi introdotti stessa cellula di lievito, oppure fusione di 2 ceppi aploidi lievito Il dominio BD si può legare al DNA ma la trascrizione inizia solo se viene portato AD nella giusta posizione Preda o

12 Utilizzo del fattore di trascrizione di lievito GAL4, che legando il promotore di LacZ permette la trascrizione della β-galattosidasi. Se cè interazione tra le due proteine GAL4 attiva entrambi i 2 domini e trascrive il gene LacZ. Se nel mezzo di coltura è presente X-Gal, la β-galattosidasi è in grado di scinderla e le colonie diventano blu. Lacz Interazione tra i 2 domini = GAL4 attivo β-galattosidasi + X-Gal Prom SISTEMA DEL DOPPIO IBRIDO IN LIEVITO Si cresce la colonia di lievito blu e si caratterizza il plasmide con inserito il DNA della proteina preda (o bersaglio)

13 Clone 1 e clone 2 ibridi inseriti in cellule di lievito Clone 1 ibrido inserito in cellule di lievito Screening di libreria di ricombinanti

14 Applicazioni: può rivelare un gran numero di interazioni che possono facilitare la decifrazione della funzione genica Possibilità di falsi positivi e negativi da verificare con altri metodi

15 CROMATOGRAFIA PER AFFINITA (pull-down)


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