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DROSOPHILA. Ciclo vitale 3mm 0,5mm 1d 4d 1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd. La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana.

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1 DROSOPHILA

2 Ciclo vitale 3mm 0,5mm 1d 4d 1 coppia di moscerini genera CENTINAIA di individui in 14dd. La progenie diventa matura sessualmente in 1 settimana. La drosophila ha un ciclo vitale rapido Fecondazione/embriogenesi 1d 3d

3 1)Ha un ciclo vitale rapido e produttivo 2)Animale piccolo, facile da sfamare e da crescere (molti individui in poco spazio) 3)Piccolo genoma: 105 Mb (5% genoma umano 4)4 cromosomi (2 autosomi + X + piccolo) 5) geni 6)100 anni di genetica 7)75% geni umani identificati in Drosophila MA…….. 1) I ceppi non possono essere congelati. Richiesta di coltura continua. 2) Non è possibile effettuare RICOMBINAZIONE OMOLOGA (no gene targeting) La Drosophila è un ottimo sistema modello:

4 RAGGI IONIZZANTI (raggi X): SI: produzione di rotture cromosomiche visibili. Facile identificazione del gene NO: mutagenesi complesse in porzioni limitate di tessuto 1/1000 MUTAGENESI CHIMICA (EMS etc.) SI: mutagenesi di singole basi del genoma NO: difficili da localizzare 1/10000 MUTAGENESI mediata dai TRASPOSONI (P-elements etc.) SI: singolo evento facile da localizzare (gene reporter) NO: non random. Solo alcuni geni sono bersaglio. METODI PER CREARE DROSOPHILA MUTANTE (TRANSGENICA)

5 Il 15% del genoma di Drosophila è MOBILE Esistono 80 tipi differenti di ELEMENTI TRASPONIBILI Lunghezza tra bp (media 5Kb) Da 1 a 1000 copie nel genoma (circa 50/genoma) Molti sono specie specifici 1)ELEMENTO COPIA 2)ELEMENTO P: elemento mobile del genoma. lunghezza variabile tra bp Elementi mobili in Drosophila Aggiunta RECENTISSIMA nel genoma di Drosophila Melanogaster Studi del 1992 hanno osservato che gli elementi P provengono da unaltra specie che ha contaminato la D.m. intorno al 1950.

6 Lelemento P

7 Gli elementi P si muovono mediante un meccanismo di COPIA e INCOLLA Gli elementi P sono presenti sui cromosomi di TUTTI I TESSUTI ma LA TRASPOSASI E ATTIVA SOLO NELLE CELLULE GERMINALI ORF0-ORF1-ORF2 ORF0-ORF1-ORF2-ORF3 STOP

8 Lelemento P In presenza della TRASPOSASI, qualsiasi frammento di DNA posto tra le regioni terminali invertite puo essere MOBILIZZATO Lelemento P si integra preferibilmente nelle estremità 5-3 del gene ospite o tende ad inserirsi nelle vicinanze di altri elementi P ed ha una leggera preferenza per sequenze target GGCCAGAC CEPPO di DROSOPHILA con elemento P (circa copie): ceppo P CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M Lelemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI Tutto ciò che è allinterno delle seq ripetute viene mobilizzato

9 Disgenesi degli Ibridi Incapacità di certi ceppi di Drosophila di incrociarsi in modo Produttivo poiché generano ibridi sterili (benché fenotipicamente simili) Gli IBRIDI generati da questi incroci sono DISGENICI: Aberrazioni cromosomiche Mutazioni Sterilità Alterata segregazione alla meiosi

10 Disgenesi degli Ibridi è ASIMMETRICA Lelemento P è CAUSA della DISGENESI DEGLI IBRIDI CEPPO di DROSOPHILA con elemento P: ceppo P CEPPO di DROSOPHILA senza elemento P: ceppo M

11 Disgenesi degli Ibridi Nel citoplasma delle UOVA di ceppo P Elevati livelli di repressore LA TRASPOSASI E ATTIVA SOLO NELLE CELLULE GERMINALI (splicing) Riarrangiamenti cromosomici STERILITA Nel citoplasma delle UOVA di ceppo M NO Repressore SI Trasposasi

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13 Elemento P come vettore per il trasferimento genico Spradling and Rubin (Science 1982) sviluppano un sistema per lintegrazione delle sequenze clonate nellelemento P nei cromosomi della linea germinale PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P + TRASPOSASI

14 PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P PLASMIDE DONATORE: 1)transgene di interesse (tra seq ripetute invertite 5P-3P) 2)gene reporter (LacZ) 3)Gene marker (wt+ occhi rossi) PLASMIDE conTRASPOSASI: 1)Codifica per trasposasi 2)Sequenza ripetuta 5p difettiva TRASPOSASI INATTIVA Embrione wt -/- Iniezione dei 2 vettori in embrione precoce DNA esogeno entra in alcune cellule Nelle cellule della linea germinale: elemento P TRASPONIBILE

15 PRODUZIONE DI DROSOPHILA TRANSGENICA con elemento P

16 ROSY - ROSY + ROSY -

17 1.ENHANCER TRAP 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI DROSOPHILA TRANSGENICA

18 TECNICA dellENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto linfluenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette lattività dellenhancer. Tecnica utilizzata per: 1)Identificazione di nuovi geni 2)Analisi dellespressione di geni tempo/tessuto specifici 3) Permette analisi molti geni simultaneamente

19 TECNICA dellENHANCER TRAP A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi Lattività dellenhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal. A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4

20 A) Enhancer TRAP P(LacZ)

21 1)LINEE ENHANCER TRAP a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di oltre 4000 ceppi b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di espressione

22 B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence) Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni LIEVITO DROSOPHILA

23 2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

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25 GAL4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

26 GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

27 GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica IL TRANSGENE (GENE X ) E ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO 1)Promotore UBIQUITARIO 2)Promotore SPECIFICO (spazio) 3)Promotore Temp-SENS (tempo) Collezione di ceppi di Drosophila

28 PROMOTORE Tessuto specifico GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

29 GAL4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI SPAZIOTEMPO

30 Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI WT MUTATO DELETO antisenso UAS/Cbl oncogeneWT GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

31 GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

32 Studio del PROMOTORE Drosophila puo essere un ottimo strumento per lANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ Il geni ibrido viene fuso nellelemento P e inserito nellembrione Lattività della betagalattosidasi permette di identificare La regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

33 Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Studio del PROMOTORE Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

34 embrione

35 cervello

36 intestino ghiandole salivari


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