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Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito allaltro del cromosoma Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione.

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Presentazione sul tema: "Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito allaltro del cromosoma Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione."— Transcript della presentazione:

1 Elementi trasponibili Sequenze che hanno la capacità di muoversi da un sito allaltro del cromosoma Diversamente dagli altri processi coinvolti nella ristrutturazione genomica, per la trasposizione non cè nessuna omologia tra le sequenze del sito donatore e accettore sito donatore sito accettore

2 GATCA CTAGT sito bersaglio ripetizioni dirette del sito bersaglio GATCA CTAGT GATCA CTAGT

3 Gli elementi IS Le IS sono unità autonome e codificano solo per le proteine necessarie alla propria trasposizione. Sono costituenti comuni di cromosomi e plasmidi Trasposasi IR IS2, IS3, IS4, IS5 InsA IR InsB 768 bp IS1 210 bp 273 bp E.coli 3-12 Shigella Serratia 2 { lunghezza media sequenze IS: bp lunghezza media IR: bp

4 altri geni IR sequenza IS Trasposoni composti trasposonelunghezza modulomarcatori genetici (bp)terminale Tn3 4957Amp Tn Hg Tn Utilizzazione lattosio Tn5 5700IS50Kc Tn9 2500IS1Cm Tn IS10Tet Tn IS1Enterotossina stabile al calore

5 IS trasposizione in un sito adiacente Origine dei trasposoni composti IS 1 o più geni batterici

6 GGGTTTCCAAA CCCAAAGGTTT GGGTTTCCAA A C CCAAAGGTTT Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un trasposone La trasposasi induce tagli sfalsati nel sito bersaglio

7 Formazione di sequenze ripetute dirette nel sito bersaglio di un trasposone G GGTTTCCAA GGTTTCCAA A C CCAAAGGTT CCAAAGGTT T inserzione del trasposone riempimento delle interruzioni GGGTTTCCAA A C CCAAAGGTTT

8 Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni Inattivazione del gene bersaglio promotore DNA mRNA proteina

9 Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni Inattivazione del gene bersaglio promotore DNA mRNA proteina assente o tronca

10 gene 1 P gene 2gene 3 mRNA policistronico P Nel caso di trasposizione in un operone si osserva un effetto polare Anche i geni 2 e 3 non vengono espressi in quanto la trascrizione è bloccata dall elemento trasponibile

11 Cambiamenti genetici prodotti dai trasposoni Attivazione di geni silenti promotore debole DNA gene non trascritto o scarsamente trascritto gene altamente trascritto promotore forte Elementi trasponibili hanno spesso promotori direzionati verso lesterno

12 I trasposoni svolgono un ruolo importante nel movimento dei geni per la resistenza agli antibiotici e altri geni da un genoma a un plasmide e viceversa Lodissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella promotore debole Il ceppo iniziale di Klebsiella era poco resistente ai beta-lattamici poichè il gene ampC era scarsamente trascritto ampC Il gene ampC di K. pneumoniae codifica per una -lattamasi

13 Lodissea evolutiva del gene ampC di Klebsiella ampC Sotto la selezione degli antibiotici il gene ampC ha acquisito due sequenze IS con il risultato di essere maggiormente trascritto conferendo un livello di resistenza clinicamente significativo promotore forte IS Il risultante trasposone è stato capace di muovere ampC in un plasmide coniugativo, oggi diffuso a molti ceppi di Klebsiella Quello che un tempo era un gene di resistenza clinicamente irrilevante è diventato il terrore degli ospedali – tutto grazie alle IS S 111

14 X Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni delezione

15 X Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni inversione ad a d ad bc b c cb

16 Riarrangiamenti prodotti dai trasposoni fusione di repliconi formazione del cointegrato

17 sequenza ripetuta invertita di 38 bp tnpA trasposasi tnpRbla resolvasib-lattamasi sito di risoluzione del cointegrato il trasposone Tn3

18 Un virus trasponibile: il batteriofago Mu E un virus temperato In seguito ad infezione, il suo DNA si integra in siti distribuiti casualmente sul cromosoma Tra i batteri lisogeni si osservano mutanti dovuti allinattivazione per integrazione del profago Si replica mediante trasposizione (una nuova copia del DNA virale è inserita in un punto diverso del cromosoma batterico) Come i trasposoni è in grado di promuovere riarrangiamenti del materiale genetico (delezioni, inversioni, fusione di repliconi ecc.)

19 A Bc immunità integrazione replicazione geni della testa e della coda regione G invertibile La mappa genetica del fago Mu C

20 Il plasmide di resistenza R1

21 IS3 IS3 IS2 inc, rep oriT A L E B C F H G S D I F J K 94 Kb Gli elementi trasponibili sono responsabili dellintegrazione del fattore F

22 Ladattamento dei batteri Strategie di adattamento mutazione regolazione dellespressione genica regolazione della trascrizione regolazione della traduzione regolazione post-traduzionale trasferimento genico orizzontale

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24 T 82 T 84 G 78 A 65 C 54 A 45 T 80 A 95 T 45 A 60 A 50 T 96 regione -35regione -10 RNA polimerasi e inizio della trascrizione

25 RNA polimerasi Complesso proteico di D costituito da 5 subunità: 2 Nucleo enzimatico Fattore sigma Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è in grado di iniziare la trascrizione al sito corretto. Il fattore sigma è responsabile del corretto riconoscimento del promotore. Viene rilasciato appena inizia la trascrizione. 2

26 Fattori sigma alternativi e regolazione globale dellespressione genica Subunità sigma Geni trascrittiSegnale in E. coli s 70maggior parte dei geni s 32geni heat-shocktemperatura elevata s 55geni regolati dallazotocarenza di ammonio s 38geni da stress ossidativiagente ossidante Ogni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.

27 La sporulazione in Bacillus subtilis e i fattori sigma alternativi La sporulazione rappresenta un drastico cambiamento dello stile di vita del batterio La transizione da una fase allaltra si realizza attraverso cambiamenti globali dellespressione genica mediati da fattori sigma alternativi Subunità sigma Geni trascritti s 43fase vegetativa s 32inizio sporulazione s 29inizio sporulazione (fase II) gp28sporulazione intermedia gp33-34fasi finali della sporulazione

28 regione ricca in GC serie di U Terminazione Rho-indipendente 5-A-A-A-G-C-C-G-C-C-G-N-N-N-N-N-C-C-G-G-C-G-G-C-U-U-U-U-U-U-U-3

29 la polimerasi continua la trascrizione terminatore la polimerasi termina la trascrizione

30 Terminazione Rho-dipendente

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33 Loperone lac ZYAO lacZ: -galattosidasi lacY: -galattoside permeasi lacA: -galattoside transacetilasi Geni strutturali mRNA policistronico regolazione coordinata: tutti i geni si esprimono allunisono P Il gene regolatore lacI codifica per la proteina regolatrice (repressore) I mRNA DNA proteine

34 Induzione: sintesi di enzimi in risposta alla comparsa di un substrato specifico Cellule di E. coli, in assenza di lattosio, contengono poche molecole di -galattosidasi (<5) lattosio glucosio galattosio In presenza di lattosio, nel giro di pochi minuti, vengono sintetizzate fino a 5000 molecole di -galattosidasi (5-10% delle proteine totali) La molecola che causa la produzione dellenzima capace di metabolizzarla è chiamata induttore La capacità di agire da induttore è altamente specifica. Molecole strutturalmente affini al lattosio possono agire da induttori della - galattosidasi ma non vengono metabolizzate: una molecola con questa caratteristica è chiamata induttore gratuito (IPTG) Se linduttore è rimosso la sintesi degli enzimi si blocca

35 ZYAOPI Il repressore previene la trascrizione legandosi a una sequenza di DNA chiamata operatore. repressore RNApolimerasi Loperone lac è sottoposto a regolazione negativa In presenza della proteina regolatrice è bloccata la trascrizione dei geni strutturali. La proteina regolatrice prende il nome di repressore

36 In che modo loperone lac risponde allinduttore? ZYAOPI induttore Il repressore ha due siti di legame: un sito per il legame alloperatore e il secondo per il legame dellinduttore Quando il repressore lega linduttore subisce una modificazione conformazionale che porta ad una diminuita affinità per il sito operatore (esempio di controllo allosterico)

37 ZYAOPI repressore Mutazioni a carico delloperatore Mutazioni nel gene O (O c ) portano allespressione costitutiva dei geni strutturali: vengono trascritti in assenza dellinduttore Costitutivi sono gli enzimi il cui livello è costante in tutte le condizioni di crescita

38 Mutazioni nel gene I (I c ), a carico del sito di riconoscimento delloperatore, portano allespressione costitutiva dei geni strutturali ZYAOPI Mutazioni a carico del repressore repressore

39 Mutazioni nel gene I (I S ), a carico del sito di riconoscimento dellinduttore, sono responsabili della super-repressione: i geni strutturali non vengono più indotti in presenza dellinduttore ZYAOPI Mutazioni a carico del repressore repressore induttore

40 Un altro sistema di regolazione negativa: la tossina di Corynebacterium diphtheriae La tossina viene prodotta quando il livello di ferro nella gola è basso geni per la tossina OP gene regolatore repressore trascrizione e produzione della tossina repressore ferro La molecola effettrice (il ferro) non è un induttore bensì un co-repressore Un sistema in cui la molecola effettrice coopera con il repressore per bloccare la trascrizione è definito reprimibile S80

41 B151 La regolazione positiva dellespressione genica Nel controllo positivo, la proteina regolatrice promuove il legame della RNA-polimerasi al promotore RNApolimerasiattivatore gene1gene2gene3 gene regolatore P activator binding site induttore Lattivatore non si lega al DNA in assenza dellinduttore

42 trascrizione P P ABS trascrizione P ABS P = promotore ABS = activator binding site

43 Il regulone Il regulone è linsieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway Il regulone del maltosio è sotto controllo positivo gene1gene2gene3 gene regolatore P activator binding site maltosio attivatore + maltosio

44 Gene o operonelocalizzazione arg A 60 min arg B-C-E-H 88 min arg D 72.5 min arg F 6 min arg G 68 min Il regulone per la biosintesi dellarginina Esempio di regulone sottoposto a controllo negativo: tutti i geni per la catena biosintetica dellarginina sono regolati da un repressore

45 Sistemi di controllo globale dellespressione genica Un batterio può regolare molti geni diversi simultaneamente in risposta a cambiamenti ambientali. Spesso più operoni o reguloni diversi possono essere attivati o disattivati Il regulone è linsieme di più geni o operoni sotto il controllo della stessa proteina regolatrice. I geni che lo costituiscono sono implicati nello stesso pathway Se geni e operoni appartengono a pathway differenti si parla di moduloni ESEMPI: regolazione mediante fattori sigma alternativi risposta SOS repressione da catabolita

46 Fattori sigma alternativi e regolazione globale dellespressione genica Subunità sigma Geni trascrittiSegnale in E. coli s 70maggior parte dei geni s 32geni heat-shocktemperatura elevata s 55geni regolati dallazotocarenza di ammonio s 38geni da stress ossidativiagente ossidante Ogni fattore sigma riconosce una classe di promotori con specifiche sequenze consensus -35 e -10.

47 Repressione da catabolita Quando un batterio cresce in un mezzo contenente glucosio come risorsa di energia, la sintesi di enzimi catabolici non correlati viene inibita In presenza di diverse fonti di energia, il batterio sceglie per prima quella più facilmente utilizzabile Gli enzimi per il catabolismo del glucosio sono costitutivi Circa 300 geni di E. coli sono regolati mediante repressione da catabolita

48 La crescita diauxica Tempo (ore) esaurimento del glucosio induzione galattosidasi utilizzazione del glucosio utilizzazione del lattosio Densità batterica Crescita in un terreno contenente glucosio e lattosio il glucosio inibisce la sintesi di -galattosidasi durante la fase di latenza viene espresso loperone lac e sintetizzata -galattosidasi Il tasso di crescita può variare

49 H OH O Adenina OH H O CH2 H O HO-P=O ATP Adenilato ciclasi AMP ciclico Il glucosio inibisce lattività delladenilato ciclasi e il livello di cAMP La molecola effettrice della repressione da catabolita è AMP ciclico

50 ZYAOPI CAP binding site cAMP CAP CAP attiva Ognuno degli operoni che CAP controlla è anche sotto il controllo di una proteina regolatrice specifica Loperone lac è regolato positivamente da CAP

51 Lattenuazione della trascrizione OP trpR trpDtrpEtrpC trpB Loperone triptofano Loperone è sotto il controllo negativo del repressore codificato dal gene trpR Il triptofano agisce come corepressore, attivando il repressore e bloccando la trascrizione repressore inattivo triptofano repressore attivo P262

52 Lattenuazione della trascrizione OP trpR trpDtrpEtrpC trpB Loperone triptofano peptide leader (14AA) attenuatore 1234 codoni trp leader 162 nt mRNA

53 UUUUUUU Attenuatore (terminatore della trascrizione) mRNA Se al segmento 1 viene impedito di appaiarsi con il segmento 2, questultimo si appaia con il segmento 3. Il 4 rimane singolo e non si forma il terminatore

54 Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola lattività della RNA polimerasi 1234 mRNA peptide leader AUG UGA Se è presente sufficiente triptofano il ribosoma sintetizzerà il peptide leader arrivando fino al codone di stop. Il ribosoma sporge sul segmento 2 impedendogli lappaiamento con il segmento AUG UGA

55 2 3 La polimerasi continua La polimerasi termina la trascrizione 2 3 4

56 Il comportamento del ribosoma durante la traduzione del peptide leader regola lattività della RNA polimerasi 1234 mRNA peptide leader AUG UGA Se manca il triptofano, il ribosoma si fermerà in corrispondenza dei 2 codoni trp adiacenti impedendo al segmento 1 di appaiarsi con 2. Il segmento 2 si associa con il segmento AUG UGA

57 Agendo insieme, repressione e attenuazione possono coordinare la velocità di sintesi degli enzimi biosintetici per gli amminoacidi con la disponibilità degli amminoacidi e la velocità globale della sintesi proteica. Quando il triptofano è presente ad alte concentrazioni, qualsiasi RNA polimerasi non bloccata dal repressore probabilmente non oltrepasserà la sequenza dellattenuatore. La repressione riduce la trascrizione di circa 70 volte e lattenuazione la riduce ulteriormente di 8-10 volte: quando entrambi i meccanismi operani insieme, la trascrizione può essere ridotta di circa 600 volte. Sembra che lattenuazione abbia un ruolo importante nella regolazione della biosintesi di molti amminoacidi Prescott pag. 262

58 Rbs = ribosome binding site (Shine-Dalgarno) 5-AGGAGG-3 Regolazione traduzionale Operone per le tossine batteriche Due geni di un singolo operone possono essere tradotti in quantità diverse La proteina A entra nella cellula e provoca il danno La proteina B si lega al bersaglio (cellula umana)

59 Regolazione post-trascrizionale mediante RNA antisenso LRNA antisenso ha una sequenza complementare a una molecola di mRNA. Il legame dellRNA antisenso può bloccare la traduzione dell mRNA.

60 sok Sistema host cell killing del plasmide R1 hok mRNA: emivita 20 min sok mRNA: emivita < 1-2 min 128 bp SD hok Il sistema hok/sok di alcuni plasmidi a basso numero di copie assicura il mantenimento del plasmide allinterno di una popolazione batterica

61 OmpR mRNA per OmpF EnvZ OmpF sintesi di OmpC micF RNA 174 b OmpC La risposta allosmolarità in E. coli

62 Regolazione post-traduzionale Un enzima della catena può legare il prodotto finale che funziona da inibitore Se il prodotto finale viene sintetizzato in eccesso o se diventa disponibile nellambiente, non è più conveniente per il batterio continuare a sintetizzarlo Controllo tipico della via biosintetica degli amminoacidi modificazione allosterica Questo tipo di controllo è anche definito inibizione a feedback


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