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1.ENHANCER TRAP 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI DROSOPHILA TRANSGENICA.

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Presentazione sul tema: "1.ENHANCER TRAP 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI DROSOPHILA TRANSGENICA."— Transcript della presentazione:

1 1.ENHANCER TRAP 2. SOVRAESPRESSIONE di TRANSGENI 3. STUDIO DI PROMOTORI DROSOPHILA TRANSGENICA

2 TECNICA dellENHANCER TRAP Un enhancer trap contiene un promotore minimo, insufficiente di per sé, per indurre la trascrizione. Se, dopo la trasposizione si inserisce in una regione sotto linfluenza di un enhancer genomico, la sequenza inserita dovrebbe essere trascritta in maniera che riflette lattività dellenhancer. Tecnica utilizzata per: 1)Identificazione di nuovi geni 2)Analisi dellespressione di geni tempo/tessuto specifici 3) Permette analisi molti geni simultaneamente

3 TECNICA dellENHANCER TRAP A) Enhancer TRAP P(LacZ): gene reporter codifica per la beta-galattosidasi Lattività dellenhancer è localizzata tramite immunoistochimica o reazione con X-gal. A) Enhancer TRAP P(LacZ) e B) Enhancer TRAP GAL4

4 A) Enhancer TRAP P(LacZ)

5 1)LINEE ENHANCER TRAP a) Banche di drosophila con pattern espressione, collezione di oltre 4000 ceppi b) Con incroci specifici si possono studiare vari pattern di espressione

6 B) Enhancer TRAP GAL4: sistema di Lievito. GAL4 attiva trascrizione di geni a valle di UAS (Upstream Activating Sequence) Utilizzato per IDENTIFICARE NUOVI GENI e SOVRAESPRESSIONE di geni LIEVITO DROSOPHILA

7 2) Enhancer TRAP GAL4 per identificazione di NUOVI GENI GAL4 è prodotto SOLAMENTE se si inserisce sotto enhancer Gene reporter (LacZ/GFP) è espresso solo se GAL4 lega la seq UAS

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9 GAL4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI

10 GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto specifica

11 GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica IL TRANSGENE (GENE X ) E ESPRESSO SOLAMENTE NEL TESSUTO SPECIFICO 1)Promotore UBIQUITARIO 2)Promotore SPECIFICO (spazio) 3)Promotore Temp-SENS (tempo) Collezione di ceppi di Drosophila

12 PROMOTORE Tessuto specifico GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica ESISTONO MIGLIAIA di CEPPI di DROSOPHILA CHE ESPRIMONO GAL4 IN DIFFERENTI TESSUTI E STADI DIFFERENTI DELLO SVILUPPO

13 GAL4/UAS SOVRA-ESPRESSIONE/SILENZIAMENTO di TRANSGENI SPAZIOTEMPO

14 Tecnica molto utilizzata per studio di ONCOGENI WT MUTATO DELETO antisenso UAS/Cbl oncogeneWT GAL4/UAS: sovraespressione di TRANSGENI tessuto/tempo specifica

15 Studio del PROMOTORE Drosophila puo essere un ottimo strumento per lANALISI del PROMOTORE: identificazione di regioni NECESSARIE per la funzione del Promotore Vengono prodotti MUTANTI di DELEZIONE fusi al gene LacZ Il geni ibrido viene fuso nellelemento P e inserito nellembrione Lattività della betagalattosidasi permette di identificare la regione MINIMA del PROMOTORE e sequenze NECESSARIE alla sua regolazione

16 Analisi del PROMOTORE del gene DRONC: caspasi di Drosophila essenziale per apoptosi durante lo sviluppo embrionale del moscerino. Studio del PROMOTORE Distinct promoter regions regulate spatial and temporal expression of the Drosophila caspase dronc T J Daish, D Cakouros and S Kumar

17 embrione cervello intestino ghiandole salivari

18 Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans ANDREW FIRE*, SIQUN XU*, MARY K. MONTGOMERY*, STEVEN A. KOSTAS*, SAMUEL E. DRIVER & CRAIG C. MELLO RNA interference Fire at al, Nature V391 pp (1998)

19 dsRNAi is cut in nt fragments Zamore et al, Cell, v101 pp25-33 (2000)

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21 Ambion Inc. Austin, Texas, USA

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