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CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00.

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1 CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00

2 Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse. ANIMALI TRANSGENICI : definizione

3 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

4 1)VETTORI RETROVIRALI Permettono il trasferimento e lintegrazione di materiale genetico nella cellula ospite

5 Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Svantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

6 VETTORI VIRALI

7 Ciclo vitale di un retrovirus genoma a RNA, 2 copie Lenzima trascrittasi inversa converte lRNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. Lapparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

8 Lunga sequenza terminale ripetuta Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Proteina strutturale capside Trascrittasi inversa e integrasi Proteina per involucro Genoma retrovirale Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE

9 Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR) Infettano facilmente cellule in attiva replicazione Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA E PRODUZIONE GENE X

10 Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per lassemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina limpacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

11 Utilizzo vettori retrovirali: TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: Correggere un difetto genetico Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

12 Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dellespressione del gene terapeutico Non dovrebbe essere patogeno. Amministrabile direttamente nel paziente. In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. Ben tollerato. Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU UTILIZZATO OGGI E IL VETTORE RETROVIRALE

13 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

14 2) MICROINIEZIONE del DNA Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

15 Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35) Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono microiniettati con DNA lineare contenente il transgene (circa 200 copie) allinterno del pronucleo maschile Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi. Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione è nella linea somatica o germinale

16 Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva, che darà origine alla nascita di un topino chimera (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nellincrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

17 EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Al max 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica!!!

18 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

19 2) Cellule staminali embrionali (ES cells) Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

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24 CALCIO FOSFATO CALCIO FOSFATO Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule LIPOSOMILIPOSOMI Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali Il DNA allinterno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONE IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA PCR Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando buchi e permettendo lentrata di DNA esogeno Integrazione Sito specifica RICOMBINAZIONE OMOLOGA

25 SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio TRANSGENE di interesse Gene che conferisce resistenza alla G418 Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

26 SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA ASPECIFICA SPECIFICA 1)Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA 2)Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

27 METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

28 PCR ASPECIFICASPECIFICA

29 Il GENE TRAPPING 1) Consente lisolamento di nuovi geni 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato 3) È mutagenico: produce knockout X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

30 STRATEGIA DEL GENE TRAP Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento Selezione dei cloni tramite marker Localizzazione dellinserto nel clone selezionato ANALISI DEL FENOTIPO

31 ELEMENTI necessari per gene trap: Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo Entrapment vector contenente : - gene reporter - marker di selezione

32 Cellule staminali embrionali di Topo SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto Integrazione Sito specifica

33 Geni reporter The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal) The firefly luciferase gene The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene Lac Z staining: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nellorgano in toto sia in specifici tessuti/cellule.

34 Elementi importanti per espressione di un gene e utilizzati per il GENE TRAPPING Promotore combinazione di elementi ai quali si lega lRNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene Enhancer corte sequenze che stimolano lattività trascrizionale di un promotore

35 Enhancer trap Vector Promoter trap V. Gene trap V. Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

36 Enhancer DNA RNA protein PROTEIN X β-gal Neo R Promotore MINIMO lac Z P' pA Endogenous gene X Vector Integration Vector neo Enhancer Trap Exon 1Exon 2Exon 3 Promotore MINIMO lac Z neo lac Z neo Promotore e pA INDIPENDENTI

37 Endogenous gene X lac Z pA P' neo pA Vector Integration DNA RNA protein β-gal Neo R Promoter Trap PROTEIN X lac Z neo Vector PROMOTORE Promotore ASSENTE Promotore e pA INDIPENDENTI

38 SA Endogenous gene X SA pA P' pA Vector Integration DNA RNA protein Spliced transcript β-gal Neo R Gene Trap SA PROTEIN X Vector lac Z neo lac Z neo lac Z neo Promotore ASSENTE Introne gene X Promotore e pA INDIPENDENTI Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

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40 RICAPITOLANDO………….. Il GENE TRAPPPING consente 1)Identificazione NUOVI GENI 2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) 3)ANALISI dellESPRESSIONE di GENI


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