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PIANTE TRANSGENICHE. PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base.

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PIANTE TRANSGENICHE. PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base.

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1 PIANTE TRANSGENICHE

2 PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche la possibilità di rigenerare unintera pianta da singole cellule differenziate in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano proliferazione e differenziamento) CALLI :ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito. GERMOGLI RADICI

3 Foglia sterilizzata Auxina/Citochina RADICI GERMOGLI CALLO RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

4 Auxina/ Citochina germogliradici

5 PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE 1)Agrobacterium tumefaciens 2)Bombardamento

6 Agrobacterium tumefaciens Batterio del suolo Gram- Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpite COLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)

7 Agrobacterium tumefaciens Plasmide Ti (induttore del Tumore) Contiene il T-DNA (transfer DNA) T-DNA 12-24Kb Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante

8 Agrobacterium tumefaciens Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide Ti Lattivazione dei geni VIR è necessaria per lintegrazione nel DNA della pianta T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica Le regioni ripetute alle estremità (25bp) IMPORTANTI per meccanismo di taglio e integrazione PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNA DOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A.t.

9 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE Svantaggi: 1)Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta 2)Produzione dellOpina non è utile per la pianta (dannosa?) 3)Plasmidi Ti sono grandi ( Kb) 4)Plasmidi Ti non hanno ORI

10 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2 METODI Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina Per amplificare il plasmide in E.Coli 1) VETTORE BINARIO No geni VIR Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO geni VIR

11 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE 2) VETTORE COINTEGRATO RICOMBINAZIONE

12 1) VETTORE BINARIO2) VETTORE COINTEGRATO

13 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE DICOTILEDONIMONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso lutilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso

14 Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA Utilizzato per saggi RAPIDI BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta Possibilità di inserzioni MULTIPLE Bombardamento Utilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni Utilizzato per inserire DNA in: Monocotiledoni Sospensioni di cellule vegetali Colture di callo Embrioni immaturi Polline di molte piante Mitocondri e cloroplasti

15 Bombardamento Particelle doro o tungsteno,ricoperte da DNA (precipitato con CaCl2/spermidina) sono accelerate a m/s con un cannone da particelle (polvere da sparo, elio, aria compressa) A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEO Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti

16 Agrobacterium e Bombardamento Introduzione del DNA solo nel NUCLEO Introduzione del DNA anche in cloroplasto/mitocondrio Infetta solo DICOTILEDONI Infetta MONOCOTILEDONI DICOTILEDONI EMBRIONI etc

17 ALTRI METODI

18 ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana

19 L Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Le piccole dimensioni Il breve ciclo vitale Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)

20 L Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO: Facilità nel divenire transgenica Notevole disponibilità di mutanti Elevata produzione di semi (1 pianta: semi) d:0,5mm

21 Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta GFP: Green Fluorescent protein LUCIFERASI GUS: -D-glucuronidasi

22 da E.coli GENE reporter uidA codifica per GUS Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica: Colorazione istochimica: X-Gluc Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronidep-nitrofenil β-D-glucuronide Saggi fluorimetrici: il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide

23 Studio dei PROMOTORI/ENHANCER (promoter trap/enhancer trap) Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina/G418 Per amplificare il plasmide in E.Coli PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo Gene REPORTER

24 ENHANCER TRAP (GUS)

25 ENHANCER TRAP (GFP)

26 GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

27 COLLEZIONE di Arabidopsis GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

28 T1-T6 lunedi 10/05 ora:16-18 T7-T12 giovedi 13/05 ora:16-18 D1-D6 lunedi 17/05 ora:16-18 D7-D11-P4 giovedi 20/05 ora: P1-P7 lunedi 24/05 ora: P8-P14 giovedi 27/05 ora: 16-18


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