La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00."— Transcript della presentazione:

1 CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00

2 ANIMALI TRANSGENICI : Metodologie e Applicazioni DROSOPHILA TRANSGENICA PIANTE TRANSGENICHE: Metodologie e Applicazioni OGM AGRICOLO ALIMENTARI

3 G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1 G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2 G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI G 23/04: Lez4 DROSOPHILA G 30/04: Lez5 PIANTE G 07/05: Lez6 PIANTE G 14/05: PRESENTAZIONI (3 a lezione) 15m G 21/05: PRESENTAZIONI G 28/05: PRESENTAZIONI G 04/06: PRESENTAZIONI

4 Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse. ANIMALI TRANSGENICI : definizione

5 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

6 1)VETTORI RETROVIRALI Permettono il trasferimento e lintegrazione di materiale genetico nella cellula ospite

7 Vantaggi dei vettori non virali Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Svantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nellospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

8 VETTORI VIRALI

9 Ciclo vitale di un retrovirus genoma a RNA, 2 copie Lenzima trascrittasi inversa converte lRNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. Lapparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

10 RNA DNA

11 Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus Il genoma tipico contiene 3 geni – Gag (componenti del core nucleoproteico) – Pol (replicazione e ricombinazione) – Env (componente della membrana esterna)

12 Lunga sequenza terminale ripetuta Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Proteina strutturale capside Trascrittasi inversa e integrasi Proteina per involucro Genoma retrovirale Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE

13 Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR) Infettano facilmente cellule in attiva replicazione Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA E PRODUZIONE GENE X

14 Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per lassemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina limpacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

15

16

17

18 Utilizzo vettori retrovirali: A) TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: Correggere un difetto genetico Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

19 TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE CLASSICHE E importante stabilire se il processo citopatico risulta da: Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel gene provoca perdita della funzione genica introduzione del gene normale OK Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una proteina con funzioni diverse da quelle della proteina normale introduzione del gene normale INEFFICACE

20 Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dellespressione del gene terapeutico Non dovrebbe essere patogeno. Amministrabile direttamente nel paziente. In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. Ben tollerato. Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU UTILIZZATO OGGI E IL VETTORE RETROVIRALE

21 Vettori Retrovirali: Pro situazione attuale e prospettive future – efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione (linee tumorali) linfociti e precursori delle linee ematopoietiche – notevole esperienza clinica ex vivo Contro – integrazione random attivazione di oncogeni shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione – capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb) - Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)

22 Somministrazione diretta del gene terapeutico in vivo alle cellule: iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico) somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica) Problemi: Trasferimento quantitativamente limitato Rischio di inserimento in cellule sane Reazione immunitaria TERAPIA GENICA IN VIVO

23 Trapianto di cellule geneticamente modificate: Estrazione/preparazione delle cellule primarie o di linea Trasferimento del gene in vitro Reimpianto delle cellule TERAPIA GENICA EX VIVO Problemi: Cellule autologhe ingegnerizzate: laboriosa, vita limitata Cellule eterologhe ingegnerizzate: reperibilità, compatibilità IN VIVOEX VIVO

24 ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari. La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA IMMUNODEFICIENZA ADA e TERAPIA GENICA: 1)Il gene ADA è piccolo e clonato nel )Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO 3)Livello di espressione puo variare senza conseguenze (range &) TERAPIA GENICA per deficit dellADA

25 Trial clinico per deficit ADA (1990)

26 PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA 1.Stabilità despressione del transgene nel tempo 2. Mutagenesi inserzionale 3. Regolazione dellespressione del transgene (promotori inducibili) 4. Cell targeting 5. Pericolosità, Etica

27 Utilizzo vettori retrovirali: B) PRODUZIONE TOPI TRANSGENICI SVANTAGGI -Max 8Kb -Lanimale puo risultare contaminato da retrovirus delle cellule helper

28 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

29 2) MICROINIEZIONE del DNA Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

30 Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35) Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono microiniettati con DNA lineare contenente il transgene (circa 200 copie) allinterno del pronucleo maschile Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi. Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione è nella linea somatica o germinale

31 INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA (circa copie del gene da inserire). A monte del gene (cDNA) da trasferire nel pronucleo si utilizza una sequenza promotore che puo conferire al gene la specificità di espressione in un particolare tessuto

32 Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva, che darà origine alla nascita di un topino chimera (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nellincrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

33 Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano sotto forma di concatameri a partire dai primissimi stadi di sviluppo. Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie. Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente analizzatati per valutare se il transgene si esprime in, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione ATG * PromotoreIntrone Poly-ACDS

34 EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Al max 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica!!!

35 Utilizzo microiniezione del DNA ANIMALI COME BIOREATTORI

36 Utilizzo microiniezione del DNA ANIMALI COME BIOREATTORI

37 SVANTAGGI -Integrazione casuale del transgene -Integrazione multipla copia (effetto tossico?) -Bassa efficienza (50 animali transgenici/1000 uova inoculate) nonostante questo… E IL METODO PIU UTILIZZATO PER LA PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

38 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

39 2) Cellule staminali embrionali (ES cells) Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

40

41

42

43

44 CALCIO FOSFATO CALCIO FOSFATO Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule LIPOSOMILIPOSOMI Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali Il DNA allinterno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana ELETTROPORAZIONEELETTROPORAZIONE IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA PCR Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando buchi e permettendo lentrata di DNA esogeno Integrazione Sito specifica

45 SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio TRANSGENE di interesse Gene che conferisce resistenza alla G418 Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

46 SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA ASPECIFICA SPECIFICA 1)Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA 2)Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

47 METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

48 PCR ASPECIFICASPECIFICA

49 Utilizzo ES cells: DISTROFIA Morbo di PARKINSON SCLEROSI MULTIPLA Patologie neoplastiche Patologie non neoplastiche Disordini metabolici genetici Leucemie mieloidi acute Aplasia midollare grave Mucopolisaccarido si Leucemie linfoidi acute Emoglobinuria parossistica notturna Tesaurismosi Leucemie mieloidi croniche Anemia di Fanconi Altri disturbi metabolici rari Sindrome mielodisplastica Anemia di Blakfan- Diamond Linfoma non Hodgkin Talassemie Linfoma di Hodgkin Anemia falciforme Leucemia linfatica cronica Altre emoglobinopatie Mieloma Multiplo Immunodeficienza grave combinata Leucemia a cellule capellute Osteopetrosi


Scaricare ppt "CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00."

Presentazioni simili


Annunci Google