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Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso.

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Presentazione sul tema: "Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso."— Transcript della presentazione:

1 Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse. ANIMALI TRANSGENICI : definizione

2 Vettori retrovirali (terapia genica) Microiniezione del DNA nel pronucleo maschile (in zigoti fertilizzati) Cellule staminali embrionali (trasfezione/elettroporazione blastocisti)

3 Cellule staminali embrionali TOPO CHIMERA

4 In P3 lassortimento genotipico segue le regole mendeliane per lincrocio tra due eterozigoti È necessario selezionare la progenie per avete topi con un genotipo omogeneo eterozigote o omozigote P1 Il topo chimerico (P1) puo avere la mutazione nella linea germinale (in eterozigosi) oppure no. P2 P3 P1

5 ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trapping KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

6 Gene trapping: inserzione in una cassetta CASUALE Gene targeting: inserzione in un gene SPECIFICO mutagenesi MIRATA STRATEGIE PER LA PRODUZIONE DI ORGANISMI TRANSGENICI

7 GENE TRAPPING Per fare topi transgenici su vasta scala generalizzata, senza un solo target...ma anche per identificare nuovi geni Gene trapping is a form of insertional mutagenesis specifically designed to disrupt gene function by producing intragenic integration events.

8 Integrazione casuale nel genoma di un costrutto contenente un gene reporter (entrapment vector) Integrazione produttiva porta il gene reporter sotto la regolazione trascrizionale di un gene endogeno

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10 Il GENE TRAPPING 1) Consente lisolamento di nuovi geni 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato 3) È mutagenico: produce knockout X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

11 STRATEGIA DEL GENE TRAP Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento Selezione dei cloni tramite marker Localizzazione dellinserto nel clone selezionato ANALISI DEL FENOTIPO

12 ELEMENTI necessari per gene trap: Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo Entrapment vector contenente : - gene reporter - marker di selezione

13 Cellule staminali embrionali di Topo SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto Integrazione Sito specifica

14 Geni reporter The E.coli lacZ gene (produzione di beta-Gal) The firefly luciferase gene The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene Lac Z staining: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nellorgano in toto sia in specifici tessuti/cellule.

15 Elementi importanti per espressione di un gene e utilizzati per il GENE TRAPPING Promotore combinazione di elementi ai quali si lega lRNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene Enhancer corte sequenze che stimolano lattività trascrizionale di un promotore Poliadenilazione aggiunta di circa 200 A allestremità 3 di un mRNA. La coda poly(A) è importante per la stabilità dellmRNA

16 Enhancer trap Vector Promoter trap V. poly A trap V. Gene trap V. Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING

17 Enhancer DNA RNA protein PROTEIN X β-gal Neo R Promotore MINIMO lac Z P' pA Endogenous gene X Vector Integration Vector neo Enhancer Trap Exon 1Exon 2Exon 3 Promotore MINIMO lac Z neo lac Z neo Promotore e pA INDIPENDENTI

18 Endogenous gene X lac Z pA P' neo pA Vector Integration DNA RNA protein β-gal Neo R Promoter Trap PROTEIN X lac Z neo Vector PROMOTORE Promotore ASSENTE Promotore e pA INDIPENDENTI

19 SA P' SD Vector Integration pA β-gal Neo R DNA RNA protein Poly A Trap Endogenous gene X SA PROTEIN X lac Z neo lac Zneo lac Z neo Vector Promotore e pA INDIPENDENTI

20 SA Endogenous gene X SA pA P' pA Vector Integration DNA RNA protein Spliced transcript β-gal Neo R Gene Trap SA PROTEIN X Vector lac Z neo lac Z neo lac Z neo Promotore ASSENTE Introne gene X Promotore e pA INDIPENDENTI Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

21 Gene Trap

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24 RICAPITOLANDO………….. Il GENE TRAPPPING consente 1)Identificazione NUOVI GENI 2)Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) 3)ANALISI dellESPRESSIONE di GENI

25 PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007 Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting. GENE TARGETING Mario R. Capecchi Martin J. Evans Oliver Smithies

26 GENE TARGETING Mutagenesi MIRATA mediante ricombinazione omologa in cellule ES Permette la creazione di una mutazione in un gene PREDETERMINATO Questa mutagenesi può avere come risultato: 1)INATTIVAZIONE dellespressione di un gene (KNOCK-OUT) 2)DIMINUZIONE dellespressione di un gene (KNOCK-DOWN) 3)INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (correzione) (KNOCK-IN) IL GENE TARGETING SFRUTTA LA RICOMBINAZIONE OMOLOGA

27 Nelle cellule di Mammifero la RICOMBINAZIONE OMOLOGA è un evento MOLTO RARO (a differenza del Lievito) La frequenza di questo evento aumenta se il grado di OMOLOGIA di sequenza tra il DNA introdotto (esogeno) e il GENE BERSAGLIO (endogeno) è molto elevata Per questo il clone di DNA esogeno è una sequenza ISOGENICA (derivante dallo stesso ceppo murino)

28 vettori utilizzati per GENE TARGETING 1)VETTORI DI INSERZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-OUT) 2) VETTORI DI SOSTITUZIONE (per produzione di TOPI KNOCK-IN) Gene di interesse M: marker esterno alla regione omologa Gene di interesse M: marker interno alla regione omologa Singolo evento di ricombinazione Distruzione del locus genico: KO Doppia ricombinazione Sostituzione di parti del locus genico 1)Per correggere un gene 2)Per produrne forma inattiva

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30 Un topo KO per un gene X non sempre ha fenotipo Per effetto di RIDONDANZA GENETICA (presenza nel genoma di altri geni con funzione simile) PER QUESTO PUO ESSERE NECESSARIO PRODURRE DOPPI/TRIPLI KO DOPPI e TRIPLI KNOCK-OUT

31 La famiglia delle Serin-treonine chinasi PIM Ruolo di PIM …esempio di TRIPLO KO………

32 Solo il triplo KO ha un fenotipo Mice Deficient for All PIM Kinases Display Reduced Body Size and Impaired Responses to Hematopoietic Growth Factors PIM1 KO: nessun FENOTIPO PIM2 KO: nessun FENOTIPO PIM3 KO: nessun FENOTIPO

33 Ruvinsky I. et.al. Genes Dev. 2005;19: …esempio di KNOCK-IN……… Qual è limportanza della FOSFORILAZIONE della proteina ribosomale S6??? ?

34 Ribosomal protein S6 phosphorylation is a determinant of cell size and glucose homeostasis S6K1 KO: rpS6 fosforilata! S6K2 KO: rpS6 fosforilata! S6K1/K2 doppioKO: rpS6 fosforilata! ……..esiste unaltra chinasi (o piu di una!!) Unica soluzione……..RPS6 KNOCK-IN non fosforilabile

35 MUTAGENESI CHIMICA/FISICA Mutagenesi chimica: ENU (Etil-Nitrosurea) EMS (Etil-Metilsolfonato) Mutagenesi fisica : raggi X Mutagenesi RANDOM LABORIOSA ANALISI FENOTIPO E IDENTIFICAZIONE GENE MUTATO PER CORRELARE GENE/FENOTIPO

36 CONFRONTO TECNICHE MUTAGENESI GENE TRAPPING GENE TARGETING MUTAGENESI CHIMICA

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38 G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1 G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2 G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI G 23/04: Lez4 DROSOPHILA G 30/04: Lez5 PIANTE G 07/05: Lez6 PIANTE (3 a lezione) 15m ognuna G 14/05: PRESENTAZIONI 1A 1B 1C (topi tecniche) G 21/05: PRESENTAZIONI 2A 2B 2C (topi KO K-In) G 28/05: PRESENTAZIONI 3A 3B 3C (topi KO K-In) G 04/06: PRESENTAZIONI 4A 4B 4C (Drosophila) G 11/06: PRESENTAZIONI 5A 5B 5C (piante)


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