La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Lezione venerdì 22_XII_=& transgenia. Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al momento giusto e nel posto giusto Ci sono.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Lezione venerdì 22_XII_=& transgenia. Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al momento giusto e nel posto giusto Ci sono."— Transcript della presentazione:

1 Lezione venerdì 22_XII_=& transgenia

2 Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al momento giusto e nel posto giusto Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al ligando (ligand binding domain LBD) dellormone degli estrogeni, in modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche non viene somministrato lormone sintetico che riconosce il recettore e fa traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP (vedi esempio della figura precedente) Condizioni di funzionamento

3 Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con Gene Targeting sito e tempo specifici. (Methods 24, 2001, pag 71-80) D.Metzger e P.Chambon - limitazioni del Gene targeting : lassenza della funzione colpita (targetet) da mutazione durante le fasi di sviluppo puo risultare letale precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi iniziali e successivi a quello letale. - molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule durante lontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca fenotipi complessi e complica lindividuazione di cellule anomale prodotte da fenomeni con piu cause. -leffetto di una mutazione puo essere compensata durante lo sviluppo manca il fenotipo alterato nellanimale adulto. -Per famiglie di geni si devono mutare piu geni della stessa famiglia per prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude lidentificazione di una funzione di un componente della famiglia genica. CRE LOX

4 - Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo essere ancora piu complicato quando la famiglia e coinvolta in un sistema pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per lacido retinoico o FGF. - Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il rischio di danno sulla fertilitae disordini sistemici. - In tutti questi casi sara problematico determinare la funzione di un gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo. - inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni somatiche come il cancro - Quindi la necessita di avere un metodo con linattivazione condizionale di un gene e molto forte Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1. Geni pleiotropici

5 Metodi per interferire con lespressione di un gene: stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells P.N.A.S. vol.99 n.3 pp P.J.Paddison et al. - mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori - knock out per ricombinazione - anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore) - RNA antisenso trascritto da un vettore - oligo antisenso Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in certi casi non sono regolabili. LRNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della interferenza e legata al sistema Dicer, cioe ad un pathway enzimatico che riduce lRNA specifico del messaggero in frammenti. E stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre un RNA a doppio filamento per bloccare lenzima Dicer stesso CRE-LOX ed RNA interference condizionale

6 fosforilazione PKR (kinasi) EIF2 dimerizzazione Blocco non specifico della traduzione 2- 5 oligodenilato polimerasi Cofattore per la ribonucleasi non - specifica (Rnasi L) dsRNA esogeno (~ 500 bp) P GFP ZEO r L L Gene per la resistenza alla zeocina; ZEO r GFP Le prime 500 bp codificanti di enhanced gr. fluor. prot. EGFP; L Lox P; P Promotore di citomegalovirus; pcDNA3 attiva Sistema cellulare di difesa antivirale Soppressione stabile dellespressione genica tramite RNA interference in cellule di mammifero

7 P GFP ZEO r L L P GFP ZEO r L L Ricombinasi CRE ZEO r dsGFP Modello per interferenze con Cre-Lox

8 Rapporto FF:REN Riduzione di 10 volte dellespressione di FF in cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN FF = firefly luciferase REN = renilla luciferase ds = double strand ss = single strand as = antisense Espressione di CRE

9 Lezione OrgTransgenici La selezione tramite incroci ha prodotto organismi innaturali almeno quanto gli organismi transgenici. Per quanto riguarda la trasmissione orizzontale di informazione genetica ci sono prove che sia avvenuta per via naturale ed il pericolo che avvenga con geni esogeni a specie diverse che ne sono privi esiste. Ma si deve sapere se i geni che si usano possono creare rischio. Sicuramente il criterio di cautela è il più sicuro. Le stesse preoccupazioni sono state giustamente poste quando iniziarono i clonaggi con vettori di espressione usando batteri e reistenze ad antibiotici. Sono nati i laboratori a contenimento negativo da cui non possono uscire batteri ricombinanti.

10 Organismi trangenici Dopo lesperienza con i procarioti è stato possibile fare organismi transgenici con organismi eucariotici. La difficoltà non era sulla complicazione della manipolazione di organismi pluricellulari, ma solamente tecnici. Cioè la manipolazione del DNA è sempre la stessa, il problema è veicolarlo ed integrarlo nei genomi. A differenza dei batteri non ci sono plasmidi nelle cellule degli organismi complessi. Lintegrazione in un genoma può creare dei problemi sia al frammento da integrare sia al genoma ospite. Cè stata e cè una notevole differenza tra i modi di produrre organismi transgenici vegetali o animali. Per alcuni organismi vegetali si possono usare con facilità dei trasposoni che facilitano lintegrazione nel genoma. Per integrarsi un costrutto deve comunque ricombinare. Finchè non erano note molte sequenze la ricombinazione era esclusa anche perché evento raro ( )

11 Oragnismi transgenici II Per fare ricerca i primi organismi transgenici sono stati la Drosofila ed il Topo e tra i vegetali Arabidopsis e Nicoziana. In generale sono stati usati gli organismi modello già usati in genetica di cui cerano sufficienti informazioni. Per gli organismi vegetali il problema principale è la veicolazione del DNA attraverso le protezioni esterne come la cellulosa, per cui o sono stati usati virus o batteri trasformanti o micro sfere ti metallli pesanti (oro) come proiettili adsorbiti col DNA. Negli animali le cellule sono più facilmente penetrabili e però luso dei virus come veicolo è il metodo più efficiente, però resta il pericolo del virus che deve essere deattivato e non deve ricombinare per ridare origine al virus wild type infettivo. Nel topo la tecnica iniziale è stata quella di utilizzare la blastocisti che era già utilizzata dai biologi dello sviluppo. Il primo successo è stato ottenuto generando un topo chimerico.

12 Topi chimerici e transgenici Per fare un organismo transgenico si deve arrivare a trasformare le cellule della linea germinale oppure il nucleo dello zigote. Nel topo in cui è problematico intervenire sugli uni e sullaltro è stato utilizzata la blastocisti su cui già veniva fatta sperimentazione. La facilità di uso dipende dal fatto che si riconosce più facilmente da uno zigote e si riesce a trovare facilmente nellutero di una topolina accoppiata durante la notte. Dopo laccopiamento in poche ore si forma un tappo vaginale che è il segno dellavvenuta fecondazione. La topolina da accoppiare viene trattata con estrogeni per far avvenire lovulazione e per aver un buon numero di blastocisti. I primi topi chimerici sono stati ottenuti iniettando direttamente il DNA nella blastocisti che lo riassorbe e con buona probabilità riesce a trasformare le cellule.

13 Dal chimerico al transgenico Iniettando il DNA nella blastocisti qualche cellula potrà assorbire il DNA, ma non tutte e quindi si otterrà un topo chimerico in cui non tutti i tessuti hanno nel genoma il DNA iniettato (con un costrutto adatto per essere funzionale ed esprimersi, cioè un gene completo e più spesso artificiale, recante un promotore forte costitutivo come quello di un virus). Questo tipo di vettore se porta un gene per una resistenza ad un antibiotico non deve essere diffuso fuori dal laboratorio. Tra questi topi chimerici ci potrebbe essere quello che ha assorbito e ricombinato nella linea germinale e che quindi può dare origine ad una linea transgenica. Quindi va fatto un incrocio con un topo della linea isogenica per poter riconoscere eventualmente dal pelo se si è trasmesso il gene marcatore. Quindi se si ottiene una F1 transgenica si reincrocerà sempre con topi isogenici a quelli utilizzati per fare il topo chimerico.

14 Controllo del topo transgenico Come si può essere certi che il topo sia transgenico a parte il colore del pelo (non sempre si associa un marcatore per il colore del pelo) ? Si deve analizzare il DNA dellanimale, nel caso del topo si prende un frammento della coda che non provoca troppo trauma o danno fisico e se ne analizza il DNA tramite Southern blot o tramite PCR. Per sapere dove si è integrato si deve clonare il frammento corrispondente a quello del Southern con PM alterato e sequenziarlo, con PCR si deve fare PCR inversa e trovare la sequenza dei frammenti limitrofi al costrutto integrato. Se il gene che si esprime corrisponde ad un fenotipo atteso, oppure diverso dal wt si ha questa ulteriore verifica. Per sapere se si sono integrate più copie con il Southern si ha risoluzione migliore e cosa si vede? Per PCR inversa cosa si deve fare per vedere se cè più di una copia ?

15 Schema in cui si mostra liniezione con cellule, col DNA è uguale

16 Come si forma la blastocisti

17 Stadi diversi di maturazione dalla morula alla blastocisti

18 Ricombinazione omologa e cellule ES Topi transgenici con iniezione diretta del DNA nella blastocisti possono avere il gene esogeno in un punto qualunque del genoma e non sempre si potrà esprimere come vorremmo, dipende dal sito in cui si inserisce. Potrebbe essere un sito silente oppure che provoca danno ad una funzione del topo, per cui non è vitale. Soprattutto si riesce solo a fare esprimere un gene e non si può interferire con una funzione genetica endogena del topo, caso mai si interferisce col metabolismo. Capecchi ed alcuni altri sono riusciti a coltivare cellule ES embrionali staminali di topo e a trasformarle per cui si poteva ottenere un topo chimerico con efficienza iniettando le cellule già con il DNA integrato e sapendo anche dove ecc. La cosa più eclatante è stata la possibilità di ottenere cellule ES trasformate con DNA ricombinato in un sito specifico per ricombinazione omologa. Prime prove con gene HPGRT

19 Vettore per Ricombinazione omologa I primi esperimenti di ricombinazione omologa furono fatti da Capecchi con il gene per la resistenza HGPRT ipoxantina-guanina fosforibosil Transferasi. Il problema e di selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono pochi i geni con un fenotipo selettivo, in tale assenza di norma si utilizza la res. per un antibiotico. Il costrutto per far avvenire la ricombinazione omologa deve avere una regione omologa a quella con cui vogliamo ottenere la ricombinazione: w.t. mut. vettore a struttura Di solito si utilizza un costrutto che abbia due regioni di omologia (spalle) rispetto alla regione che si vuole inserire. La frequenza e stata studiata ed e ~ 1- 2 x10 -6 x

20 Controlli per lintegrazione di vettori con ricombinazione omologa Controlli delle cellule staminali ES con cui si devono ottenere successivamente i topi transgenici. La trasformazione delle cellule ES si può fare per elettroporazione o con metodi trasfettanti che permeabilizzano la menbrana, si aliquotano le cellule e si opera la selezione per lantibiotico. Si espandono le colonie per avere cloni isogenici (tutte le cellule di un clone hanno avuto lo stesso evento di ricombinazione). Si analizzano i diversi cloni per PCR per vedere se la ricombinazione è avvenuta come desiderata, cioè tramite le spalle del vettore nel sito omologo. Il vettore conterrà nella regione non omologa di solito una resist. E magari un marcatore di espressione (lac z che può far colorare di azzurro le cellule ricombinanti con lindicatore). Si amplifica per PCR partendo dal vettore con una regione esterna

21 PCR di controllo di integrazione genoma org resist. antibiot. ab a e b sono le sequenze omologhe al gene con cui si vuole fare avvenire la ricombinazione ed il Knock out della funzione, per cui per verificare lintegrazione con PCR un primer dovrà essere nella regione esogena e laltro nella regione genomica limitrofa alla sequenza che è stata inserita nel vettore che è presente in entrambe e così permette la ricombinazione omologa

22 Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene ela possibile mortalita degli omozigoti durante lo sviluppo. - una soluzione per questo problema potrebbe essere linduzione della mutazione tempo e tessuto specifica - e stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox utilizzato anche in biologia cellulare perche inducibile - Cre e la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri - i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale di 8bp - la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se ce un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si integra (vedi fig. 1) Topi transgenici mutanti condizionali

23 Mutanti condizionali Il sistema cre-lox Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre. Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due introni diversi) allesterno della regione genetica da eliminare. Si chiamano floxed gli esoni o le regioni da excidere. Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con lespressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.

24 Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule sensibili al Ganciclovir Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra eliminato e le cellule potranno essere eliminate con la selezione dellantibiotico Dopo leliminazione della resistenza alla neomicina per linduzione del gene Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti esone xesone y introne x esone z gene tk loxP - neo - loxP loxP costrutto esone x esone y esone z loxP esone xesone y introne x esone z gene tk ricombinaz. e delez. neo gene tk induz. di Cre omologa ricombinaz. loxP - neo - loxP introne x loxP costrutto ricomb. neo Il costrutto per il gene floxed

25 Topi transgenici che esprimono Cre Controllo dellespressione di Cre tramite promotore tessuto specifico Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6) il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum) Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) gal si colora in blu perché libera lespressione eliminando un gene floxed interposto tra il promotore e LacZ.

26 sito per topi con costrutti Cre Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi

27 costrutto per un gene del SNC pJOJO CMV-IE actina loxP-GFP-loxP IRES lacZ - poly A cDNA Ngi Ngi Nerve growth inibitor da gene trapping CMV promotore del citomegalovirus IE enhancer actina di pollo GFP green fluor. protein floxed IRES internal ribosome entry site di encefalomiocardite Lac Z per la galattosidasi

28 Lattivita di molti enzimi ( oncoproteins, fattori di trascriz., RNA-binding prot., kinasi ) puo essere controllata in maniera dipendente dal Ligando se fusa al dominio che lega il ligando LBD ( ligand binding domain ) di un recettore di un ormone steroideo. E stata fatta una proteina chimerica attiva della ricomb. Cre - LBD del recettore dellestrogeno (ER) per cui lattivita della ricombinasi Cre-ER dipende dalla presenza di 17 -estradiol. Per non avere il controllo della proteina in presenza di estradiolo endogeno: e stato mutato il LBD del recettore ER (Cre-ER T ) in maniera da legare solo un ligando sintetico ( tamoxifen =Tam, 4idrossi tamoxifen=OHT ) sfruttando la mutazione nota ( Gly 525 Arg ). Questo costrutto funziona in cellule in vitro. -Esperimento di espressione del gene in topo transgenico : costrutto messo sotto il controllo del promotore/enhancer del gene IE di CMV ( citomegalovirus ) il frammento PvuII del costrutto pCMVCre-ER T iniettato in zigoti F1( C57BL/6XSJL ), analisi del transgene da DNA caudale. Ligand inducible Cre Recombinase

29 floxed per il gene del recettore dellacido retinoico RXR dopo induzione di Cre (controllo di funzionalità di Cre) RXR wt RXR targetet floxed gene ) E8E9 7 8 E8 LoxP Tk neo E8E9 RXR targetet floxed gene After CRE recombinase ) Prodotto di PCR 156 bp Primers 7 e 8 Prodotto di PCR 190 bp Primers 7 e 8 skin kidney spleen liver stomach uterus lung brain muscle hearth thymus tail Excision of floxed marker mRNA CRE Er % Livello di espressione di CRE (pallini) e di excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda Prova di espressione e funzionamento su un topo transgenico

30 Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp : Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al. Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con vettori per geni reporter o selezionabili. -linserzione genera la marcatura (tags) di geni successivam. clonabili -espressione solo se linserzione avviene in introni, esoni o promotori di geni attivi restringendo il tipo di geni marcabili -finqui non esiste automazione per lidentificazione dei geni bersaglio che possono non essere trascritti o corrispondono alla regione 5non tradotta, Per superare questi limiti sono stati sviluppati due nuovi vettori per GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20 Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap

31 VICTR3 PGKLTRSDpuroLTR VICTR20 PGKLTRSDpuroLTRSApAIRES geo vettori per il 3o 5 trapping(presenza di LTR virali per lintegrazione nel genoma ospite) Wild-type locus PGKLTRSDpuroLTRSApAIRES geo G AAAAAn G Gene trapping tramite Victr 3 e 20

32 2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK ( fofsfo glicerokinase ) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina N- acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor) - b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter ( colorimetrico ) con sito polyA (SA geobpA o SAIRES geobpA) Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere marcati ( trapped ) e la sequenza si individua tramite RACE 3 del cDNA di fusione e ricerca in banca dati del gene. -Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza della 3RACE di colonie Purom. res. hanno confermato lintegrazione nel sito corretto confermando la capacita mutagenica del costrutto. Costrutti VICTR3 VICTR20

33 Race per gene trapping gene trapping di VICTR-3/VICTR-20 VICTR-3 è costruito per funzionare con lintegrazione allinterno geni attivi e non attivi. Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare RACE 3 ed eventualmente gene walking al 5 dopo aver individuato la regione.

34 costrutti per gene trapping pA geo eeei PT1 geo lacz neo ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon geo = lac z - neo fusion pA poly adenilation signal U3 geo geo U3 RU5 Sup 5 U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk Sup 5 E. coli sup F tRNA RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer TS4 sa Lac ZP-neo


Scaricare ppt "Lezione venerdì 22_XII_=& transgenia. Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al momento giusto e nel posto giusto Ci sono."

Presentazioni simili


Annunci Google