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LEZIONE 10 Ingegneria animale I CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA 208-09 Adriana Maggi.

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1 LEZIONE 10 Ingegneria animale I CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA Adriana Maggi

2 ANIMALE TRANSGENICO: animale nel cui genoma e stato introdotto un frammento di DNA esogeno TRANSGENE frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

3 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE 1Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD) 2Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING) 3Enucleazione della cellula uovo e inserzione di un nucleo di una cellula somatica (CLONAZIONE)

4 TRANSGENESI STANDARD GENE TARGETING Microiniezione del DNA clonato zigote Embrione stadio 2 cellule Impianto nella femmina pseudogravida 10-20% dei nascituri contiene il transgene Trasfezione del DNA clonato in cellule ES Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida Topo chimerico Ibrido F % della progenie portano il transgene

5 CLONAZIONE Pecore con muso nero Cellula somatica con nucleo Pecore con muso giallo Oocita enucleato Trasferimento del nucleo nelloocita Impianto nella pecora Nascita della pecora dal muso giallo

6 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard SCOPO -GUADAGNO DI FUNZIONE- esprimere un gene esogeno (transgene) in uno o piu tessuti dellanimale. (Eccezionalmente si puo avere perdita di funzione dovuta alla integrazione del transgene in una sequenza codificante.)

7 Preparazione oociti fecondati Preparazione pseudo pregnant Screening della progenie Preparazione costrutti microiniezione Transgenesi standard METODO nel dettaglio

8 Preparazione oociti fecondati Cocktail ormonale Incrocio Recupero uova fecondate

9 Preparazione del costrutto Purificazione del transgene propagazione del transgene transgeneVettore di clonaggio

10 Impianto degli oociti microiniettati Preparazione delle pseudo pregnant Femmina Maschio vasectomizzato Incrocio

11 Prelievo delle uova fecondate Microiniezione Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nellutero di femmina pseudogravida Microiniezione e reimpianto degli oociti microiniettati

12 Screening della progenie Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per : Southern blot PCR

13 Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo Southern Blot

14 Ciclo di base Amplificazione Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo Polymerase chain reaction

15 Incroci per lomozigosi F2 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 Founder/wild type F1/F1

16 Transgenesi standard - riepilogo procedura - microiniezione del transgene negli oociti fecondati impianto nella femmina pseudogravida gravidanza e nascita dei Founder Screening dei founder incroci successivi per ottenere lanimale omozigote

17 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard Destino del DNA dopo la microiniezione integrazione stabile nel genoma della linea germinale dellanimale integrazione in singola copia o con maggior frequenza in copie multiple distribuite secondo un tipico arrangiamento in tandem integrazione nel genoma in posizione casuale tramite RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA

18 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Gene targeting SCOPO -PERDITA DI FUNZIONE- ablare un gene endogeno attraverso linserzione mirata di un transgene

19 GENE TARGETING Trasfezione del DNA clonato in cellule ES Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Topo chimerico Ibrido F % della progenie portano il transgene

20 GENE TARGETING - procedura - generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES) preparazione del vettore trasfezione delle cellule ES con il vettore iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti generazione di topi mosaico incroci successivi per ottenere lanimale con il transgene nella linea germinale

21 Generazione di cellule staminali ES Femmine dopo 3-4 giorni dal concepimento Blastocisti Espianto e messa in coltura Crescita in terreno selettivo per le ES Disaggregazione 1 passaggio Linea pura

22 Trasfezione del vettore (elettroporazione) Cellule ES Selezione delle cellule knock out Trasfezione delle ES

23 Strategia di selezione delle ES knock out Destino del DNA Integrazione random Integrazione sito specifica Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

24 Ricombinazione omologa Es. di gene targeting

25 Verifica del genotipo Southern blot PCR

26 Iniezione delle cellule ES nella blastocisti - generazione di animali mosaico -

27 Incroci per lomozigosi F2 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 Founder/wild type F1/F1

28 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Gene targeting Destino del DNA dopo la microiniezione integrazione stabile nel genoma della linea germinale dellanimale integrazione in singola copia integrazione nel genoma in un sito specifico tramite RICOMBINAZIONE OMOLOGA

29 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Clonazione - procedura - Il nucleo di cellule somatiche (ghiandola mammaria) arrestate nella fase G0 del ciclo cellulare e impiantato in un oocita enucleato nella metafase II della meiosi

30 CLONAZIONE Pecore con muso nero Cellula somatica con nucleo Pecore con muso giallo Oocita enucleato Trasferimento del nucleo nelloocita Impianto nella pecora Nascita della pecora dal muso giallo

31 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Clonazione SCOPI ottenimento di gemelli di un fenotipo di interesse nuovo metodo di transgenesi possibilita di ingegnerizzare le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo per il reimpianto

32 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Riepilogo transgenesi standard - guadagno di funzione gene targeting - perdita di funzione clonazione - generazione clonale di individui

33 GENERAZIONE DI MUTANTI CONDIZIONALI Il sistema cre-loxP Gene bersaglio LoxP CRE RICOMBINASI

34 GENERATION OF THE LID/ERE-Luc MOUSE Luciferase ERE sequences Luciferase LID (liver-specific IGF-I gene- deficient) ERE-Luciferase Albumin promoter Esone 4 Lox P Cre X X Ex 4 80% plasma IGF-I CRE LID/ERE- Luc

35 APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE DELLINGEGNERIA ANIMALE Studio di funzione genica (ricerca di base) Modelli di patologia umana Produzione di biofarmaci Modelli per lo screening di farmaci

36 Studi di funzione genica (ricerca di base) Es. Knock-out dei recettori per le lipoproteine a bassa densita e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dellaterosclerosi Transgenici per i ligandi dei recettori sopracitati (ApoE e ApoB) e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dellaterosclerosi

37 Modelli di patologia umana Utilizzi in farmacologia studio dei meccanismi patogenetici e identificazione di nuovi bersagli farmacologici test dellattivita farmacologica di composti

38 Modelli di patologia umana Malattie virali Malattie ereditarie Malattie neoplastiche Per approfondimenti Bedell et al. Genes & Development (1997) 11: p

39 Modelli di malattie virali virus umani spesso non infettano altri mammiferi Si generano modelli transgenici Es. Papovavirus JC responsabile della leucoencefalopatia multifocale sviluppo di una patologia simile nel topo transgenico per il virus

40 Modelli di malattie ereditarie monogeniche Es. Knock out per il cluster genico della beta-globina provoca beta-talassemia nel topo Ciavatta, D. J.; Ryan, T. M.; Farmer, S. C.; Townes, T. M. : Mouse model of human beta-0-thalassemia: targeted deletion of the mouse beta(maj)- and beta(min)-globin genes in embryonic stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 92: , PubMed ID : Goldberg, Y. et al., Absence of disease phenotype and intergenerational stability of the CAG repeat in transgenic mice expressing the human Huntington disease transcript. Hum. Molec. Genet. 5: , PubMed ID : Es. Transgeenico per lhuntightina mutata provoca la malattia di Huntighton nel topo

41 Modelli di malattie neoplastiche Es. Mutazioni nel gene che codifica per APC ( ADENOMATOUS POLYPOSIS OF THE COLON) predispongono ai tumori del colon. La mutazione introdotta per gene targeting anche nel topo provocainsorgenza di tumori intestinali.

42 Produzione di biofarmaci Utilizzo di vettori tessuto specifici per esprimere proteine terapeutiche nel latte o nel siero di animali transgenici

43

44 Modelli per lo screening di farmaci Topo Transgenico ERE-Luciferasi Modello per lo screening di farmaci attivi sul recettore degli estrogeni.

45 ER cDNA CMV ER trascrizione traduzione SERMS ER Co-Fact. RNA pol Luciferasi trascrizione traduzione ER Attivazione di ER SCREENING OF COMPOUNDS MODULATING ERs ACTIVITY ER RNA pol NO trascrizione prom.ERELUCIFERASIprom.ERELUCIFERASI

46 Strategia per la generazione del topo reporter ER-luc

47 INTERESSE FARMACOLOGICO DEGLI ESTROGENI Terapia endocrina dei tumori (Malattie neurodegeneragive) (Rischi cardiovascolari) Controllo della ferilita Disfunzioni endocrine Prevenzione dellosteoporosi

48 fold induction E2E ( g/Kg) fold induction E2E ( g/Kg) TIME fold induction E2E2 0h 3h6h16h 30 fold induction E2E2 0h 3h6h16h fold induction E2E2 C T + E 2 T ICI + E 2 * ° ° fold induction E2E2 C T + E 2 T ICI + E 2 ° ° * DOSEANTAGONISTS LIVER BONE LUCIFERASE EXPRESSION IN LIVER AND BONE

49 IMAGING OF ESTROGENIC ACTIVITY 6 h 24h pharmacological treatment with E2 6h 3h 0h

50 CYCLING FEMALES Estradiol (pg/ml) DIEST.-1 DIEST-2PROEST. ESTRUS LIVER E D-1 D-2 P OVARIES BONE E D-1 D-2 P BRAIN PROES.ESTR.DIEST. PED


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