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PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI - Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus) - Insetti vivi (sistema di espressione:

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Presentazione sul tema: "PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI - Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus) - Insetti vivi (sistema di espressione:"— Transcript della presentazione:

1 PRODUZIONE DI PROTEINE IN CELLULE ANIMALI - Cellule di insetto in coltura (sistema di espressione: baculovirus) - Insetti vivi (sistema di espressione: virus patogeni specifici) - Cellule di mammifero in coltura - Animali vivi come bioreattori (pharming)

2 INGEGNERIA GENETICA NEGLI ANIMALI Transgenesi: tecnologia del trasferimento genico per introdurre sequenze di DNA nel genoma di cellule animali (o vegetali) - Creazione di linee cellulari transgeniche - Creazione di animali transgenici (contengono il gene clonato in tutte le loro cellule) Scopi: - Produzione di proteine ricombinanti a scopo farmacologico (anche da animali vivi: pharming) - Creazione di modelli animali per malattie umane - Ingegnerizzazione di cellule umane per la terapia genica in vivo o ex vivo

3 METODI DI TRASFERIMENTO GENICO IN CELLULE DI MAMMIFERO 1) Trasferimento genico diretto: - trasfezione mediata da liposomi - trasfezione mediata da recettori - trasfezione DNA libero con microiniezione nel nucleo 2) Trasferimento tramite vettori - plasmidici - virali (trasduzione) 3) Tipi di Inserzione: - ectopica - mirata 4) Obiettivi: - Produzione di proteine e farmaci - Inserzione geni in cellule specifiche per creazione animali transgenici - Terapia genica somatica nelluomo

4 Trasfezione (per endocitosi) mediata da liposomi anionici o cationici DNA trasportato nellinternoDNA trasportato allesterno Trasferimento genico diretto Analogo sintetico del doppio strato fosfolipidico di membrana

5 Trasfezione (per endocitosi) mediata da recettori Trasferimento genico diretto Esempio:utilizzo recettore TfR

6 Trasfezione DNA libero con microiniezione Trasferimento genico diretto Inserzione di più copie di DNA lineare

7 Trasferimento genico tramite vettori virali Virus a DNA o ad RNA Obiettivo Introdurre e pilotare lespressione di transgeni in cellule in coltura Espressione -Transitoria per transgeni non integrati nel genoma ospite, elevata espressione ma necessario trattamento ripetuto - Stabile ma ridotta per transgeni integrati Svantaggi - Possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) - Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate - Tecniche con bassa efficienza e costi elevati

8 Sistema vettorialeOspite e localizzazione Considerazioni SV40Vari mammiferi può o meno integrarsi Adenovirus (virus raffreddore) Vari mammiferi, di solito episomico Inserto fino a 8 kb, elevato livello espressione Virus adeno-associatiVari mammiferi, si integra siti specifici cromosoma 19 Inserto fino a 4,5 kb, necessita di adenovirus per packaging Papillomavirus (cancro del collo uterino) Vari mammiferi, integrazione stabile Inserzione DNA di buone dimensioni Elevato livello espressione RetrovirusAmpia gamma, si integra come cDNA Dimensioni fino a 8,5 kb Trasferimento genico tramite vettori virali

9 Genoma 5,2 kb Promotore costitutivo forte Eliminazione di alcuni geni virali per inserire DNA esogeno Adatto a molti tipi cellulari Alta efficienza espressione transiente Limitazioni inserto per permettere packaging Siti di clonaggio Trasferimento genico tramite vettori virali

10 Virus non integrati: espressione transiente Virus integrati: espressione stabile, possibile mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Inserzione di geni (o molecole di DNA) di dimensioni limitate Tecniche con bassa efficienza e costi elevati Svantaggi Trasferimento genico tramite vettori virali

11 PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI Produzione proteine umane in grandi quantità sostituisce la purificazione da: - organi o tessuti animali di proteine animali a volte poco efficaci o con effetti allergici o contaminanti; - organi e tessuti umani (sangue o organi di cadaveri); es. purificazione ormoni della crescita da ipofisi e rischio di malattia Creutzfeld-Jacob - Produzione in batteri - Produzioni in eucarioti microbici - Produzioni in cellule animali vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche svantaggi: colture costose (supporto solido per la crescita, densità minime, uso di vettori virali e possibili conseguenze nella co-purificazione) - Produzioni in animali e piante transgenici = pharming (pharmacological e farming) vantaggi: modificazioni post-traduzionali delle proteine autentiche

12 PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE, EUCARIOTICHE O PHARMING PRODOTTOMALATTIA InsulinaDiabete SomatostatinaDisordini della crescita, acromegalia, nanismo SomatotrofinaDisordini della crescita, acromegalia, nanismo Fattore VIIIEmofilia A Interferone (vari)Leucemia e altri tumori Fattore di crescita epidermide Ulcere Fattore di crescita fibroblasti Ulcere EritropoietinaAnemia Attivatore tissutale plasminogeno Infarto

13 Proteina di fusione: pochi aa della - galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA Formazione del legame disolfuro inefficiente! Cambiata la sintesi (vedi diapo successiva) Molecola piccola non glicosilata, ponti disolfuro

14 PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : INSULINA Dopo ripiegamento spontaneo Tagli proteolitici eliminano il leader e il segmento C

15 PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOSTATINA Molto piccola: solo 14 aa = 42 bp aa della -galattosidasi di E. coli seguiti dalla metionina

16 PRODUZIONE DI ORMONI (FARMACI) RICOMBINANTI IN CELLULE PROCARIOTICHE : SOMATOTROFINA Leader sintetico: codoni 1-24 sostituiti (stessi aa) per corretta traduzione (propensione del codice) in E. coli Proteina grande: 191 aa Estrazione di mRNA ipofisario, produzione cDNA, Sito di taglio per HaeIII inserimento leader sintetico, clonaggio, trasformazione, produzione proteina

17 PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII Produzione in E. coli impossibile 26 esoni e 25 introni 2351 aa Proteina dimerica: subunità A e C con17 legami disolfuro e molti siti glicosilati Necessari 17 legami disolfuro e glicosilazione: tentativi di produzione in E. coli ma proteina non attiva!

18 PRODUZIONE DI FARMACI RICOMBINANTI IN CELLULE DI MAMMIFERO: IL FATTORE VIII I 2 cDNA per subunità A e subunità C clonati in 2 vettori di espressione plasmidici separati. Promotore Ag: ibrido sequenza -actina di pollo e -globina di coniglio Plasmidi introdotti in linea cellulare di hamster Produzione efficiente e proteina attiva FVIII prodotto anche tramite pharming (secreta come proteina del latte nel maiale)

19 SistemaSpecieProdotto LatteMaialeFattore VIII TopoAttivatore plasminogeno tissutale umano Ormone della crescita umana Fibrinogeno umano ConiglioEritropoietina umana Pecora 1-antitripisina umana Fattore IX CapraAttivatore plasminogeno tissutale umano Siero (sangue)Coniglio 1-antitripisina umana UrineTopoOrmone della crescita umana PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI

20 CREAZIONE DI ANIMALI TRANSGENICI 1) Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile di una cellula appena fecondata. Se linserimento genico riesce, tutto lanimale che ne deriva è trangenico (comprese cellule germinali) 2) Trasferimento nucleare di cellula somatica con transgene in oocita fecondato privo di nucleo e reimpianto in madre surrogata. Tutto lanimale che ne deriva è trangenico 3) Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti di madre surrogata Lanimale che ne deriva è chimerico (produrrà transgenici solo se le sue cellule germinali hanno il transgene) A monte del gene da esprimere sempre inserito un promotore, a volte con specificità tissutali

21 CLONAGGIO NELLE CELLULE DI MAMMIFERO CON MICROINIEZIONE NEL NUCLEO Trasferimento genico mediante microiniezione nel nucleo (pronucleo maschile) Microiniezione di plasmidi batterici con DNA gene da inserire Microiniezione di copie di DNA lineare (privo di vettore) Inserimento nel DNA cromosomico di copie multiple in tandem Utilizzo: permettono la produzione di animali transgenici quali modello di malattie Svantaggi: Scarsa efficienza di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale

22 Stimolazione dellovulazione in una femmina Appena dopo laccoppiamento microiniezione di DNA con il transgene (circa 200 copie) iniettato allinterno del pronucleo maschile (fatto su ovuli fecondati) Gli ovuli microiniettati vengono impiantati nellutero di una madre adottiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane: progenie e analisi. Lanimale è transgenico perché il transgene è presente in tutte le cellule Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

23 Accoppiate con maschi vasectomizzati Oocita fecondato

24 Trasferimento genico tramite microiniezione nel pronucleo maschile

25 - Ha una densità cellulare di 1000 volte superiore ad un fermentatore - Produce fino a 10g/l di proteina transgenica - Una pecora produce litri ogni ciclo di lattazione - E più economico dei comuni fermentatori - Produce corrette modificazioni post-traduzionali - Facile la purificazione (nel latte ci sono poche proteine) LA GHIANDOLA MAMMARIA COME BIOREATTORE Clonaggio a monte di un promotore espresso nella ghiandola mammaria (caseina, beta-lattoglobulina)

26 PROTEINE PRODOTTE IN FLUIDI BIOLOGICI DI ANIMALI USATI COME BIOREATTORI Produzione di Fattore VIII umano nel latte del maiale. Il cDNA umano completo a valle del promotore del gene della proteina acida del siero del latte di maiale. Sintesi di fattore VIII nel tessuto mammario del maiale e secrezione della proteina nel latte Problematiche: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei (in genere non più del 5% degli oociti iniettati dà progenie transgenica. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

27 Tecnologia del trasferimento nucleare Riprogrammazione del nucleo che ripercorrerà lintero sviluppo

28 Clonazione animale: creazione di Dolly Tecnologia del trasferimento nucleare

29 Dolly, primo esperimento riuscito di clonazione animale (1997) Problematiche della clonazione animale: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare - Alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).

30 Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti Le cellule staminali embrionali derivano dalla massa di cellule interne della blastocisti, 3,5 - 4,5 giorni dopo laccoppiamento. Possono essere mantenute in coltura con fattori che impediscono il differenziamento: totipotenti Cellule staminali pluripotenti isolate anche da feto e adulto (numero e capacità differenziative limitati)

31 NO è una CHIMERA!!! Zigote Mutazione genetica due popolazioni cellulari Mosaico Zigote 1(blastocisti) due popolazioni cellulari Chimera Zigote 2 (cellule ES) Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

32 Solo alcuni topi produrranno gameti con il transgene che daranno topi transgenici Trasferimento genico in cellule embrionali staminali (ES) e reimpianto in blastocisti

33 Meno del 5% della prole è transgenica Efficienza del trasferimento genico Problematiche: - Alta inefficienza dei metodi di trasferimento nucleare o microiniezione nei pronuclei. - Clonazione animale: alta frequenza di malattie congenite negli animali - Invecchiamento prematuro degli animali - Considerazioni etiche del pharming soprattutto nelle piante (OGM).


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