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Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI.

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Presentazione sul tema: "Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI."— Transcript della presentazione:

1 Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

2 GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER Ingegneria Animale animali mutati geneticamente ad esprimere un gene reporter

3 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD) Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)

4 TRANSGENESI STANDARD GENE TARGETING Microiniezione del DNA clonato zigote Embrione stadio 2 cellule Impianto nella femmina pseudogravida 10-20% dei nascituri contiene il transgene Trasfezione del DNA clonato in cellule ES Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida Topo chimerico Ibrido F % della progenie portano il transgene

5 Preparazione oociti fecondati Preparazione pseudo pregnant Screening della progenie Preparazione costrutti microiniezione

6 Preparazione oociti fecondati Cocktail ormonale Incrocio Recupero uova fecondate

7 Preparazione del costrutto Purificazione del transgene propagazione del transgene transgeneVettore di clonaggio

8 Impianto degli oociti microiniettati Preparazione delle pseudo pregnant Femmina Maschio vasectomizzato Incrocio

9 Prelievo delle uova fecondate Microiniezione Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nellutero di femmina pseudogravida Microiniezione e reimpianto degli oociti microiniettati

10 Screening della progenie Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per : Southern blot PCR

11 GENE TARGETING - procedura - generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES) preparazione del vettore trasfezione delle cellule ES con il vettore iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti generazione di topi mosaico incroci successivi per ottenere lanimale con il transgene nella linea germinale

12 Generazione di cellule staminali ES Femmine dopo 3-4 giorni dal concepimento Blastocisti Espianto e messa in coltura Crescita in terreno selettivo per le ES Disaggregazione 1 passaggio Linea pura

13 Trasfezione del vettore (elettroporazione) Cellule ES Selezione delle cellule knock out Trasfezione delle ES

14 Strategia di selezione delle ES knock out Destino del DNA Integrazione random Integrazione sito specifica Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

15 Iniezione delle cellule ES nella blastocisti - generazione di animali mosaico -

16 Incroci per lomozigosi F2 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 Founder/wild type F1/F1

17 REPORTER SYSTEMS TO STUDY DRUGS ACTIVE THROUGH INTRACELLULAR RECEPTORS GFP POL II, TF, co-regulators ER Reporter ERE transcription Reporter: easily detectable protein REPORTER MOUSE

18 INSULATOR ( MAR ) INSULATOR ( MAR ) light luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + TK ERE 2x firefly luciferase +/- ERE-Luc reporter mouse The ERE-Luc reporter mouse: a model to study of ER transcriptional activity Ciana et al., 2001 ERE kinase-dependent activation

19 i.p. of D-luciferin 20 min. Evaluation of ER transcriptional activity 5 min. after the acquisition

20 ERE-Luc mouse ER is transcriptionally active at day 14.5 pc dpc (day post conception)

21 ERE-Luc mouse P dpc (day post conception)post-natal day 1 endoderm mesoderm ectoderm imaging IHC A B CD E F G H C – intestine 20x D – bone 40x E – heart 40x F – forebrain 10x G – moustache 40x H – skin 20x 16.5 dpc GP Rando, 2007

22 ERE-Luc mouse MDP E Estradiol ( pg /ml) day 1day 2day3day 4 S ESTRUS E 2 (pg/ml) MDPE Luciferase activity in adult, cycling females Ciana et al, Nature Ned., 2003

23 Suckling Mice Pregnancy & Embryo Development DAY 18.5 DAY 16.5 DAY 13.5 DAY 14.5 DAY 15.5 DAY 1 DAY 10 Immature Mice Adult Mice LIFE CYCLE ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology

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28 MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS Functional Magnetic Nuclear Resonance Optical imaging Bioluminescence Ultrasound MicroPET Positron emission tomography Nuclear imaging Micro SPECT single-photon emission computerized tomography 2/06 Fluorescence

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35 PARTICULARLY, IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH! ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS (Frederic Barnhard 1927) 2/06


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