La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi,

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi,"— Transcript della presentazione:

1 Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi, cioè identiche se lette in direzione 5'--> 3' sia su un filamento che sull'altro.

2 -Servono a tagliare il DNA in modo preciso e prevedibile -Sono stati isolati più di 1200 enzimi da procarioti -Riconoscono più di 130 diverse sequenze nucleotidiche (sequenze palindromiche di 4, 6 o 8 nucleotidi). Il nome deriva dal batterio da cui è stato isolato: EcoRI E = genere Escherichia co =specie coli GAATTC R =ceppo RY13 CTTAAG I =prima endonucleasi isolata BamHI B = genere Bacillus am = specie amyloliquefaciensGGATCC H = ceppo HCCTAGG I = prima endonucleasi isolata Simmetria binaria

3 Tipi di taglio -BLUNT ENDS O TAGLIO NETTO Es. SmaI 5-CCC GGG-3 5-CCC-3 5- GGG-3 3-GGG CCC-5 3-GGG-5 3-CCC-5 -STICKY ENDS O CODINE ADESIVE: -5 PROTRUDING (5 SPORGENTE) -3 PROTRUDING(3 SPORGENTE) –Es. Eco RI (5 PROTRUDING) 5-G/AATTC-3 5-G-3 5-AATTC-3 3-CTTAA/G-53-CTTAA-5 3-G-5 –Es. Kpn I (3 PROTRUDING) 5-GGTAC/C-3 5-GGTAC -3 5-C-3 3-C/CATGG-5 3-C-53-CATGG-5

4

5 Quante volte taglia un enzima Probabilità di trovare un sito di restrizione: basiprobabilità 4(1/4)4 = 1/256 5(1/4)5 = 1/1024 6(1/4)6 = 1/4096 8(1/4)8 = 1/65536

6

7 DNA ligasi

8 defosforilazione

9 Gel elettroforesi

10 Southern blot Il Southern Blot è una tecnica che permette di identificare la presenza del frammento di DNA che a noi interessa tra una miscela di tantissimi frammenti.

11

12

13 Chimica del DNA Soluzione viscosa a pH 7 Diminuzione viscosità a pH estremi o a T> 80°C Denaturazione ( aumento D.O) Rinaturazione (diminuzione D.O.) Formazione di ibridi anche tra catene di specie diverse I nucleotidi vanno incontro a trasformazioni chimiche (mutazioni)

14 DENATURAZIONE E RINATURAZIONE La denaturazione del DNA consiste nella separazione completa dei due filamenti complementari che lo costituiscono. Il processo inverso è detto rinaturazione.

15 ANALISI FISICA Effetto ipercromico: Aumento dellA 260nm durante il processo di denaturazione del DNA. Temperatura di melting (Tm): Temperatura in corrispondenza della quale il DNA è denaturato al 50%. Maggiore è G+C, maggiore è Tm. Grado di denaturazione (%) Temperatura (°C) Assorbanza a 260 nm TmTm Curva di fusione

16 CINETICA di RINATURAZIONE Effetto ipocromico: Diminuzione dellA 260nm durante il processo di rinaturazione del DNA. Parametri che influenzano la rinaturazione: 1) C 0 Concentrazione espressa in nucleotidi/unità di volume 2) Tempo La misura della velocità di rinaturazione può fornire utili informazioni circa la complessità del DNA Log C o t Rinaturazione (%) DNA a rinaturazione rapida Curva C 0 t DNA a rinaturazione lenta

17

18

19

20

21

22 forma Aforma Bforma Z Senso elicadestrorsadestrorsasinistrorsa Diametro26 A20 A12 A Coppie di basi per ogni giro di elica Distanza tra basi2.6 A3.4 A3.7 A Piegamento basi rispetto allasse dellelica20°6°7° Conformazione dello zuccheroC-3 endoC-2 endoC-2 endo per pirimidine C-3 endo per purine Conformazione Legame glucosidico antiantianti per pirimidine sin per purine

23 Cot Fig. 13 Curva di Cot % ss DNA rimanente

24 SONDE E MARCATURA La sonda è un frammento specifico di DNA (o RNA), reso radioattivo, capace di riconoscere una sequenza complementare di DNA o RNA in una popolazione di tanti frammenti.

25 Metodi di marcatura Nick transaltion Random priming Marcatura terminale

26

27 -3OH 5P 3OH -5P Denaturazione ed appaiamento degli esanucleotidi casuali 5P-3OH 3P5OH Enzima Klenow + dNTP* 5P-3OH 3P5OH

28 MARCATURA delle SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE RANDOM PRIMING Metodo dellinnesco casuale NICK TRANSLATION Spostamento dellincisione DNA denaturazione aggiunta di inneschi esanucleotidici 3-GCATGC-5 5-TGCAGT-3 5-GCATAC-3 3-TAGCAG-5 ibridizzazazione TAGCAG TGCAGT-3 5-GCATAC-3 Frammento di Klenow, dNTP dATP 32 P-dCTP dTTP dGTP Sintesi DNA TAGCAG TGCAGT-35-GCATAC-3 3-TAGCAG-5 DNA sonda marcato denaturazione riempimento del buco prodotto con un nucleotide radioattivo e rimozione del nucleotide successivo DNA G C G C A A G C G C G T T C G G C A A G C G C G T T C G C C A A G C G C G T T C G C G A A G C G C G T T C G C G C A G C G C G T T C 32 P-dCTP dGTP il taglio si muove in direzione 5-3 taglio di unelica e rimozione di un nucleotide mediante la DNA polimerasi I Pol I

29 3OH -5P 5P -3OH Trattamento con fosfatasi 3OH -5OH 5OH -3OH Polinucleotide chinasi+ [ 32 P]dATP 3OH -5P 5P -3OH

30 I tipi di marcatura non radioattiva sono essenzialmente: -marcatura isotopica diretta (incorporazione di nucleotidi modificati conteneti un fluorocromo, cioè un gruppo chimico in grado di emettere fluorescenza se esposto alla luce di una certa ; -marcatura indiretta ( associazione tra una molecola indicatrice e un precursore nucleotidico). I sistemi più usati sono: -Il sistema biotina-streptavidina -La digossigenina

31 HN O O N dUTP Uracile Desossiribosio Trifosfato HN O S NH Biotina Uracile C U C G A G A U G U C A U G A G C T C T A C A G T A BBBB DNA sonda DNA target A U G U C T A C A G B B EAEA EAEA A U G U C T A C A G B B FAFA FAFA Ibridazione del DNA sonda col DNA bersaglio dei cromosomi (A) Avidina-enzima(B) Avidina-fluoroforo PRINCIPIO DELLE SONDE NON RADIOATTIVE: Affinità molto elevate tra Biotina e Avidina o Streptavidina E = molecole reporter fosfatasi alcalina o -galattossidasi F = molecole reporter

32 Ibridazione Libridazione è quel processo per cui due filamenti di DNA (o RNA) possono appaiarsi e formare un ibrido (doppia elica) più o meno stabile mediante la formazione di legame idrogeno per un certo numero di basi complementari. Librido può formarsi tra DNA/DNA e DNA/RNA. Libridazione può avvenire anche tra molecole di DNA non perfettamente complementari. Sono molto importanti le condizioni sperimentali.

33

34 Condizioni stringenti Vengono definite condizioni stringenti, quelle condizioni sperimentali che permettono la migliore ibridazione. Condizioni di ibridazione piu stringenti (richiedono maggiore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): –maggiore Temperatura –minore concentrazione salina –presenza di denaturanti chimici Condizioni di ibridazione meno stringenti (permettono minore percentuale di omologia tra sonda e bersaglio): –minore Temperatura –maggiore concentrazione salina –assenza di denaturanti chimici

35 Mappe di restrizione in diagnostica

36

37 ...MAPPATURA di RESTRIZIONE 6 21 AB TRATTAMENTO DIMENSIONE dei FRAMMENTI (Kb) INTERPRETAZIONE Nessuna digestione Enzima A Enzima B Enzima A+ B 9 A 2 7 A 3 6 B A 3 6 B 43 A B

38

39

40

41 Sequenziamento con isotopi radioattivi a = adenina c = citosina g = guanina t = timina g t a c g t a c MICROSATELLITE ripetizione: adenina e citosina acacacacacacacacacacacacacacac dinucleotide :(ac) 15

42 Sangue Peli Seme 1) ESTRAZIONE DEL DNA Doppia Elica DNA Individuo AIndividuo BIndividuo Ccampione di controllo 3 paia di cromosom i omologhi 2) PCR Polymerase Chain Reaction 3) ELETTROFORESI

43 Sequenziatore Automatico Immagine Computerizzata dell elettroforesi Elettroferogramma di un campione con 12 microsatelliti PADRE MADRE FIGLIO GENOTIPO: 263/263 GENOTIPO: 263/277 GENOTIPO: 263/263 DIAGNOSI POSITIVA Profilo genetico di un campione

44 MADRE FIGLIO PADRE FIGLIO GENOTIPO: 263/277 GENOTIPO: 263/ MADRE FIGLIO PADRE FIGLIO GENOTIPO: 128/140 GENOTIPO: 128/146 GENOTIPO: 128/128 GENOTIPO: 124/128 GENOTIPO: 128/ DIAGNOSI POSITIVA DIAGNOSI NEGATIVA


Scaricare ppt "Enzimi di restrizione riconoscono sequenze specifiche, in genere di 4-6 nucleotidi, di DNA a doppio filamento. Queste sequenze sono generalmente palindromi,"

Presentazioni simili


Annunci Google