La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici IsotopoEmivitaTipo di emissione Energia di emissione 3 H 12.4 annibeta - 0.019.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici IsotopoEmivitaTipo di emissione Energia di emissione 3 H 12.4 annibeta - 0.019."— Transcript della presentazione:

1 MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici IsotopoEmivitaTipo di emissione Energia di emissione 3 H 12.4 annibeta MeV 32 P 14.3 giornibeta MeV 33 P 25.5 giornibeta MeV 35 S 87.4 giorni beta MeV Marcatura con 3 H :nucleotide con isotopo in posizioni diverse Marcatura con 32 P, 33 P: 1)nucleotidi con lisotopo nel gruppo fosfato in (marcatura interna); 2)un nucleotide con lisotopo nel gruppo fosfato in che viene sostituito dal P del nucleotide terminale (marcatura terminale con chinasi) Marcatura con 35 S: inserito nucleotide con lisotopo 35 S al posto dellO - del gruppo fosfato in posizione

2 MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE RANDOM PRIMING Klenow: attività endonucleasica 5 3 no esonucleasica 5 3 (distruggerebbe primer) si esonucleasica 3 5

3 MARCATURA INTERNA DEL DNA MEDIANTE RANDOM PRIMING

4 MARCATURA TERMINALE DEL DNA MEDIANTE POLINUCLEOTIDE CHINASI

5 MARCATURA NON ISOTOPICA - Diretta: incorporazione di nucleotidi modificati contenenti un fluoroforo (gruppo chimico che emette fluorescenza se esposto a certe lunghezze donda) - Indiretta: incorporazione di un nucleotide al quale è stato legato un gruppo indicatore (R); individuazione dellibridazione della sonda per riconoscimento di (R) da parte di un anticorpo (A) che viene evidenziato con un marcatore (M) Digossigenina (steroide vegetale) e biotina (vitamina B7) hanno un gruppo indicatore (incorporato nellacido nucleico) che può essere riconosciuto da ligandi specifici. Esempi: La biotina viene legata dallavidina (glicoproteina presente nellalbume delluovo) legata a marcatore fluorescente saggio fluorimetrico; La digossigenina viene legata da un anticorpo monoclonale coniugato con la fosfatasi alcalina saggio enzimatico con conversione di un substrato incolore

6 Fluorescin-dUTP (verde) dUTP Fluorofori per la marcatura non isotopica diretta Rhodamine-dUTP (rosso)

7 Marcatura non isotopica indiretta

8 Sonda DNA complessata con perossidasi di rafano (Horseradish peroxidase, HP) + luminolo: sviluppo di chemioluminescenza rilevata con autoradiogramma Deossiuridina trifosfato (dUTP) modificata con Biotina, ibridazione con Avidina accoppiata con marcatore fluorescente Marcatura non isotopica indiretta

9 Tipi di sonda utilizzati per libridazione degli acidi nucleici : DNA, RNA, Oligonucleotidi Tipi di ibridazione: Southern blot (in genere: marcatura isotopica) Northern blot (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione di filtri con colonie (in genere: marcatura isotopica) Ibridazione in situ di cromosomi per mappatura citogenetica (ora non isotopica) Ibridazione in situ di tessuti (ora non isotopica) Ibridazione di filtri con spot di DNA da PCR (dot blot)

10

11 IBRIDAZIONE DI UN SOUTHERN BLOT Specificità dellibridazione: Temperatura di ibridazione Concentrazione salina Temperatura lavaggi

12 IBRIDAZIONE DI UN NORTHERN BLOT

13 IBRIDAZIONE DI FILTRI CON COLONIE

14 IBRIDAZIONE IN SITU su campione intero Espressione di un gene per la crescita dei fibroblasti nellembrione di pollo. Trascritti marcati con sonda antisenso marcata con digossigenina e rilevati con anticorpi antidigossigenina accoppiati a fosfatasi alcalina

15 Procedura sperimentale: - Mitosi fissate su vetrino - Parziale deproteinizzazione con proteasi - Denaturazione ad alte temperature (90-100°C) - Ibridazione con sonda denaturata e marcata con isotopo radioattivo o colorante fluorescente - Lavaggi - Esposizione con lastra autoradiografica e sviluppo Svantaggi delluso di tritio: - Utilizzo del radioattivo - Bassa risoluzione (diffusione della radiazione ed alto background) - Bassa sensibilità MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU DI SONDE MARCATE

16 MAPPATURA CITOGENETICA CON IBRIDAZIONE IN SITU

17 - Localizzazione diretta di sonde su cromosomi metafasici - Posizionamento contemporaneo di più sonde lungo i cromosomi - Localizzazione di sonde rispetto a bande e strutture conservate (centromeri e telomeri)

18 Fluorescent In Situ Hybridization: FISH Ibridazione in situ fluorescente - Metodo diretto: Marcatura della sonda con nucleotidi coniugati a fluorocromi - Metodo indiretto: Riconoscimento della sonda con una seconda sonda marcata con fluorocromi Visualizzazione diretta al microscopio a fluorescenza - FISH SU CROMOSOMI METAFASICI (Risoluzione 1 Mb) - FISH SU CROMOSOMI INTERFASICI (Risoluzione tra Kb) - FISH SU CROMOSOMI IN INTERFASE ARTIFICIALE ( Kb) (Fiber FISH)

19 Fluorescin-dUTP (verde) dUTP MICROSCOPIA A FLUORESCENZA Rhodamine-dUTP (rosso)

20

21 Ibridazione con sonda che copre il sito di rottura cromosomica FISH

22 FISH multicolore - Utilizzo sostanza fluorescenti con diverso spettro di emissione (FITC, fluorescina isotiocianato, Texas Red, rodamina) - Utilizzo contemporaneo di sonde marcate con diversa localizzazione lungo il cromosoma

23 CHROMOSOME PAINTING - Sonde: collezione di frammenti specifici di ogni cromosoma - Ogni cromosoma risulta fluorescente ed ha un colore diverso - Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dellimmagine - Cariotipo molecolare (spectral karyotype SKY)

24 CHROMOSOME PAINTING Sonde: collezione di frammenti specifici di un singolo cromosoma Cromosomi fluorescenti con colori diversi Utilizzo di un microscopio a fluorescenza ed analisi digitale dellimmagine

25 Chromosome painting FISH multicolore


Scaricare ppt "MARCATURA ISOTOPICA Radioisotopi più usati per marcare gli acidi nucleici IsotopoEmivitaTipo di emissione Energia di emissione 3 H 12.4 annibeta - 0.019."

Presentazioni simili


Annunci Google