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Citogenetica 2 La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione.

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Presentazione sul tema: "Citogenetica 2 La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione."— Transcript della presentazione:

1 Citogenetica 2 La citogenetica e` lo studio dei fenomeni genetici attraverso l analisi citologica dei cromosomi al microscopio. Ferguson-Smith Lezione 2

2 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Analisi del cariotipo

3 sangue periferico terreno di coltura 48-96h proliferazione colchicina (ultimi 30 ) centrifugazione pellet risospeso Ipotonica (20 ) centrifugazione pellet risospeso fissativo centrifugazioni (2-3) fissativo risospensione in poco fissativo allestimento del preparato Allestimento del preparato fitoemoagglutinina (stimola la crescita)

4 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Analisi del cariotipo

5 Creano un alternanza di bande chiare e scure lungo l asse del cromosoma specifica per ogni coppia di omologhi. *Colorano una regione specifica di alcuni o di tutti i cromosomi C-bande : tutti i centromeri e le regioni eterocromatiche variabili dei cromosomi 1,9,16,Y Metodi colorazione differenziale

6 1-3 gruppo A4-5 gruppo B X-6-12 gruppo C gruppo D gruppo E gruppo F Y gruppo G Cariotipi a confronto

7 utilizzando la mostarda di quinacrina QM-banding pattern

8 DAPI e QM

9 C-bande

10 G-bande

11 G QM HSA1 HSA14

12 R-bande

13 1) Allestimento della coltura 2) Preparazione dei vetrini 3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine 4) Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi e acquisizione delle immagini Analisi del cariotipo

14 by GP&NA Ottima ma…..

15 by GP&NA Puo essere anche cosi... Cromosomi non ben riconoscibili, difficili anche da contare. Scartare! (potendo)

16 by GP&NA.. O cosi Troppo contratti pero si puo usare per contarli. Scartare! (potendo)

17 by GP&NA Selezione delle metafasi Sufficiente Si possono contare Puo essere utile per analizzare i cromosomi non sovrapposti

18 Discreta by GP&NA Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, si possono analizzare Selezione delle metafasi

19 by GP&NA Selezione delle metafasi Buona Si possono contare, e anche se ci sono alcune sovrapposizioni, la morfologia dei cromosomi e buona

20 1. SI CONTANO I CROMOSOMI : IMPORTANTE PER SOSPETTARE LA PRESENZA DI ALTERAZIONI NEL NUMERO CROMOSOMICO 2. SI APPAIANO GLI OMOLOGHI PER SIMILARITA 3. SI METTONO IN ORDINE SECONDO LA CONVENZIONE by GP&NA Come si fa il cariotipo?

21 by GP&NA Fare il cariotipo

22 CARIOTIPO IN QM (indicare il bandeggio) by GP&NA Cariotipo ordinato

23 Diagramma

24

25 46,XX - cariotipo normale Femminile 46,XY - cariotipo normale Maschile Questo modo di scrivere ci da due informazioni: - numero totale dei cromosomi (46) - sesso dell organismo 47,XY,+21 Maschio con 47 cromosomi (invece di 46) ed un cromosoma 21 in piu (sindrome di Down) 46,XX,del(14)(q23)del=delezione 46,XY,dup(14)(q22q25)dup= duplicazione 46,XX,r(7)(p22q36)r=ring (cromosoma ad anello) Terminologia

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27 doppia elica di DNA ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT osservazione del vetrino ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT denaturazione cromosoma sul vetrino sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo ibridazione della sonda sui cromosomi denaturati sul vetrino A T C G G T A T C C T A ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT T T A GGCATAGGA FISH ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT ATCGGTATCCTA T A GGCATAGGAT denaturazione

28 Principio della fluorescenza

29 by GP&NA filtro di emissione specchio dicroico filtro di eccitazione obiettivo/ condensatore fotografia CCD camera Lampada a vapori di mercurio Elaborazione al computer FISH : microscopio a fluorescenza Osservazione al microscopio

30 Cromosomi 1. denaturati 2. colorati con DAPI by GP&NA FISH: metafase in DAPI

31 Sonde puntiformi fluorescenti FISH: segnali

32 Sovrapposizione dell immagine della sonda sull immagine del DAPI FISH: merge

33 SONDE PER FISH

34 DAPI SONDA MERGE WCPWCP

35 PCPPCP DAPI SONDA MERGE

36 BAC chr1 BAC chrX SONDE PUNTIFORMI

37 COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE PUNTIFORMI COIBRIDAZIONE DI 3 SONDE PUNTIFORMI

38 COIBRIDAZIONE DI 2 SONDE PUNTIFORMI CON WPC


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