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CITOGENETICA CONVENZIONALE E MOLECOLARE. CITOGENETICA CONVENZIONALE La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e della.

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1 CITOGENETICA CONVENZIONALE E MOLECOLARE

2 CITOGENETICA CONVENZIONALE La citogenetica convenzionale è una tecnica che permette lo studio del numero e della struttura dei cromosomi (studio del cariotipo) I cromosomi vengono esaminati bloccati in metafase. Step: prelievo del campione (SP, BM o tessuto linf.) allestimento delle colture cellulari allestimento dei preparati bandeggio dei cromosomi

3 Allestimento delle colture e dei preparati Tecniche di coltura Diretta: terreno di coltura+colchicina 4-6 ore Medio termine: terreno + colchicina ore Sincronizzata: blocco in fase S (MTX) rimozione del blocco colchicina Allestimento preparati post-incubazione: centrifugazione soluzione ipotonica per distensione dei cromosomi centrifugazione fissativo (alcol metilico o acido acetico)

4 Tecniche di bandeggio dei cromosomi Tecniche generali (intero cromosoma) Bandeggio Q Bandeggio G Bandeggio R BANDEGGIO STATICO Tecniche speciali (porzioni cromosoma) Bandeggio C Bandeggio Cd (fuso) Bandeggio NOR geni RNA ribosomi BANDEGGIO DINAMICO Informazioni sul tipo di replica di ogni cromosoma durante la fase S (uso raro in onco-ematologia)

5 Bandeggio Q mostarda di chinacrina (intercala tra copppie di basi) contrasto tra bande: scarso non colora telomeri colora eterocromatina

6 Bandeggio R soluzione salina + Giemsa complementari a bande Q e G (soluzione salina) contrasto < a bandeggio G colora telomeri eucromatina colora poco eterocromatina

7 Cromosomi normali Cromosoma metacentrico Cromosoma submetacentrico Cromosoma acrocentrico

8 Cariotipo normale 46 cromosomi (n. diploide) 22 coppie (omologhi) autosomi (1-22) 2 cromosomi sessuali XY (M) e XX (F)

9 Anomalie cromosomiche Anomalie del numero quasi aploidi (n +/-) ipodiploidi (2n-) iperdiploidi (2n+) pseudodiploidi monosomie trisomie Anomalie strutturali traslocazioni (reciproche e non) delezioni (intersiziali o terminali) duplicazioni inversioni

10 Traslocazioni T (2;15) (p11.2;q11.2) bilanciatasbilanciata T (13;14) (p11.2;p11.2)

11 Delezioni cromosomiche Del (7) (q11.23 q21.2) delezione interstiziale braccio lungo (q) cromosoma 7

12 CITOGENETICA MOLECOLARE (FISH) La Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) è una tecnologia che utilizza sonde nucleotidiche marcate (DNA probes) per identificare specifiche regioni di un cromosoma ovvero determinate sequenze del DNA. Step: denaturazione del DNA incubazione sonda + DNA denaturato (annealing) rilevazione del segnale della sonda con microscopio a fluorescenza

13 Tipi di sonde (DNA probe) Sonde Nucleotidi + biotina o digossigenina (fluorocromo + streptavidina) (fluorocromo + Ac anti-digossigenina) nucleotidi coniugati a fluorocromi Sonde Alfoidi: per sequenze ripetitive dei satelliti (anomalie numeriche) Painting: specifiche per un cromosoma (cromosomi molto riarrangiati) Locus singolo: sequenze specifiche DNA (es. geni di fusione)

14 FISH: tappe della metodica Campioni DNA: cromosomi in metafase o nuclei in interfase

15 FISH in interfase

16 FISH in metafase probe per parte terminale del cr. 4q

17 FISH: vantaggi e limiti Vantaggi Esamina elevato n. di cellule in tempi brevi Metodica semplice Elevata efficienza di ibridizzazione Elevata sensibilità e specificità Non necessità cellule in mitosi Correla dato citogenetico con morfologico Limiti Informazioni su singolo cromosoma/gene Esame simultaneo di pochi DNA bersaglio Soglia di positività da calcolare per ogni sonda Possibili artefatti nellanalisi di inclusi in paraffina

18 Citogenetica nelle leucemie acute Classificazione delle leucemie acute (entità cliniche allinterno di un citotipo FAB) Definizione del rischio citogenetico (significato prognostico) Monitoraggio della malattia minima residua: sensibilità citogenetica convenzionale < sensibilità FISH

19 TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE

20 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Tecnica che si basa sulla capacità di una DNA polimerasi di amplificare in modo esponenziale una regione di DNA a sequenza sconosciuta (templato) posta tra due porzioni di DNA a sequenza nota. Step: Estrazione di DNA (o RNA) Cicli di amplificazione: denaturazione annealing estensione dei primers Analisi degli amplificati

21 PCR: estrazione di DNA (o RNA) DNA RNA Proteinasi + fenolo-cloroformio-alcool isoamilico time: 2 giorni Guanidio isotiocianato + mercaptoetanolo cloroformio ( a 4 °C) time: 2 giorni DNA/RNA KIT commerciali/ strumenti per automazione Concentrazione Qualità spettrofotometria 260 nm (DNA) 280 nm (proteine) A 260 A 280

22 PCR: cicli di amplificazione Miscela di amplificazione DNA templato DNA polimerasi termostabile Buffer di reazione (TrisHCl e KCl) Ione magnesio Desossinucleotidi trifosfato Primers: brevi sequenze di DNA a singolo complementari a sequenze note poste a monte e a valle del templato

23 PCR: cicli di amplificazione Denaturazione (~ 1 min 95°C) Raffreddamento e annealing dei primers (~ 1 min 45-60°C) Estensione dei primers da DNA polimerasi (~ 1 min 72°C)

24 PCR: cicli di amplificazione Cicli ripetuti volte

25 Amplificazione: crescita esponenziale ed efficienza di reazione X n = X 0 x (1 + E x ) n Efficienza della reazione Qualità e concentrazione del DNA/RNA Qualità e concentrazione del cDNA Concentrazione dei vari reagenti Condizioni di temperatura della reazione Numero di cicli plateau

26 PCR qualitativa: analisi dei risultati Elettroforesi in gel di agarosio Corsa: 1/2 ora a 150 V Colorazione con etidio bromuro UV transilluminazione Fotografia

27 Fig. 4 Roccaro et al. GAPDH Ang2 ddH 2 O 0 nM 5 nM 7.5 nM neg ctrl057.5 Bortezomib [nM] Interior area (pixel) Ang1 GAPDH ddH 2 O 0 nM 5 nM 7.5 nM neg ctrl057.5 Bortezomib [nM] Interior area (pixel) IGF-1 GAPDH ddH 2 O 0 nM 5 nM 7.5 nM neg ctrl057.5 Bortezomib [nM] Interior area (pixel) IL-6 GAPDH ddH 2 O 0 nM 5 nM 7.5 nM GAPDH ddH 2 O 0 nM 5 nM 7.5 nM VEGF neg ctrl057.5 Bortezomib [nM] Interior area (pixel) neg ctrl057.5 Bortezomib [nM] Interior area (pixel) 90 60

28 PCR qualitativa: vantaggi e limiti Vantaggi Elevata sensibilità Elevata specificità Identificazione di traslocazioni non dimostrate dalla citogenetica Possibilità di analisi simultanea delle traslocazioni più frequenti Possibilità dellesecuzione dellanalisi da campioni bioptici Limiti Possibilità di contaminazioni Efficienza di amplificazione variabile e dipendente da vari fattori Impossibilità di stabilire la q di sequenza bersaglio Presente allinizio nel campione

29 PCR quantitativa real-time Thermal-cycler (amplificazione) Sistema ottico per rilievo della fluorescenza Software per raccolta ed analisi dei dati Analisi dei prodotti non alla fine della reazione, ma durante la fase di crescita lineare delle molecole di amplificato

30 Real-time PCR: metodo Taqman Sonda specifica per target Q = fluorocromo quencher (rosso, onda lunga) R = fluorocromo reporter (verde, onda corta) Sonda Taqman si lega a DNA target I primer si legano a 3 e 5 del DNA templato

31 Real-time PCR: metodo Taqman

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34 PCR quantitativa: vantaggi e limiti Vantaggi Limiti Velocità Sensibilità (10 -4 – ) Specificità Standards commutabilità confrontabilità accuratezza Variabilità nella determinazione quantitativa Complessità sperimentale Mancanza di standards Valutazione critica dei risultati

35 TECNOLOGIA DEI MICROARRAY E LEUCEMIE ACUTE

36 DNA-microarray Metodica che consente di analizzare il profilo di espressione genica delle cellule. Procedura di base: Sequenze di DNA sono schierate in ordine su supporto solido. Dal campione viene estratto mRNA e retrotrascritto in cDNA. cDNA, marcato con tracciante fluorescente, ibridizza con sequenze su array. Il livello di espressione di un gene è direttamente proporzionale allintensità di segnale derivato dalle immagini digitali acquisite. Principali tipi di microarray: 1. membrane based cDNA microarray 2. glass slide-based cDNA microarrays 3. oligonucleotide microarray o DNA chip

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40 DNA-microarray e leucemie acute: possibili sviluppi Riclassificare le leucemie Individuare profili di espressione genica in relazione alla prognosi Individuare profili di espressione genica in relazione a vie di trasduzione del segnale per definire terapie molecolari target Individuare profili di espressione genica in relazione alla sensibilità o resistenza ad un dato farmaco


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