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By NA Lezione 2 Multicolor labeling - CGH. By NA.

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Presentazione sul tema: "By NA Lezione 2 Multicolor labeling - CGH. By NA."— Transcript della presentazione:

1 By NA Lezione 2 Multicolor labeling - CGH

2 By NA

3 Aberrazioni numeriche Aberrazioni strutturali traslocazioni, inserzioni

4 By NA Sistema combinatoriale: n=3 fluorocromi 2 n -1=7 combinazioni Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da Ried e coll. con limpiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a sette sonde genomiche.

5 By NA MARCATURA COMBINATORIALE RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi)

6 By NA Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande colorate (Muller et al 1997); MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per pseudobandeggio (Chudoba et al 1999); cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al 2001); M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000). M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996); SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996); COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi (Tanke et al 1999);

7 By NA M-FISH, SKY & COBRA (Multiplex-FISH, Spectral KarYotyping & COmbined Binary RAtio labelling) : finalità analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R): un singolo esperimento per lo studio dellintero cariotipo; sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti i riarrangiamenti cromosomici; strumento di screening per lidentificazione di nuovi riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio.

8 By NA M-FISH, SKY & COBRA: applicazioni Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e double minutes; Corretta identificazione di traslocazioni quando il pattern di bandeggiatura non è ottimale, o in metafasi di scarsa qualità; Caratterizzazione di traslocazioni complesse. Identificazione di inserzioni cromosomiche. Individuazione di riarrangiamenti criptici.

9 By NA - Non e possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune pericentriche - E difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei telomeri - Necessita di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti perche possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono regioni di dimensioni >3Mb M-FISH, SKY & COBRA: limiti

10 By NA Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma A = Rodamina B = Texas Red C = Cy 5 D = FITC E = Cy 5.5 Esempio Sistema combinatoriale: n=5 fluorocromi 2 n -1=31 combinazioni

11 By NA M-FISH methodology

12 By NA Si ottiene infine limmagine totale combinando le informazioni delle acquisizioni effettuate con i sei filtri.

13 By NA

14 Cariotipo complesso Cariotipo con M-FISH

15 By NA Cariotipo con SKY

16 By NA Marker cromosomico

17 By NA Traslocazione complessa

18 By NA RATIO IMAGE FIRST BINARY IMAGE

19 By NA riarrangiamenti intracromosomici marcatori con neocentromeri o privi di centromero risoluzione: 3Mb riarrangiamenti intracromosomici riarrangiamenti tra più cromosomi identificazione piccoli marcatori (<17p) Limiti risoluzione: riarrangiamenti submicroscopici telomerici identificazione piccoli marcatori (<17p) riarrangiamenti tra più cromosomi due esperimenti sequenziali singolo esperimento Vantaggi M-TEL-FISHcen-M-FISHM-FISH/SKY/COBRA conclusioni

20 By NA Conventional CGH Ratio Position on Chromosome Test Genomic DNA Reference Genomic DNA Cot-1 DNA gaindeletion Tumour Normal

21 By NA RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO Software per lanalisi delle immagini digitali

22 By NA

23 Small cell lung carcinoma

24 By NA Array CGH

25 By NA Espressione genica G3PDH Sequenza ibridatata su mRNA Northern Blot

26 By NA 30,000 Geni 30,000 Northerns Northern Blot

27 By NA

28

29

30 Test Genomic DNA (Tumour DNA) Reference Genomic DNA Ratio Position on Sequence Cot-1 DNA Ratio Position on Chromosome gaindeletion CGH su microarrays

31 By NA

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33 Chip fabrication Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e con precisione.

34 By NA AA** AB*** BB** Chromosome SNP SNP array

35 By NA SNP array genoma maschile normale

36 By NA SNP array genoma esempio patologico?

37 By NA SNP array 3 delezioni?

38 By NA genitore - figlio 1/2 fratelli 1/2 zio - nipote 1/4 cugini primi 1/8 cugini secondi 1/16 Condivisione genoma

39 By NA Ricombinazione mitotica(MR) Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936)

40 By NA Ricombinazione mitotica(MR)

41 By NA Ricombinazione mitotica(MR)

42 By NA Ricombinazione mitotica(MR)

43 By NA Ricombinazione mitotica(MR) origina una popolazione a mosaico

44 By NA UPD segnalata in alcuni tumori: Breast Cancer Retinoblastoma Ulveal melanoma Wilms tumour Myeloproliferative disorders (9p) Haematopoietic malignancies SNP array nei tumori

45 By NA SNP array AML

46 By NA SNP array AML

47 By NA + + UPD


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