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Ereditarietà X-Linked Madre Padre Figlia Figlio X X Y.

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Presentazione sul tema: "Ereditarietà X-Linked Madre Padre Figlia Figlio X X Y."— Transcript della presentazione:

1 Ereditarietà X-Linked Madre Padre Figlia Figlio X X Y

2 Cromosoma X Cromosoma Y Geni sottoposti ad inattivazione Geni attivi Regione pseudo-autosomica X Inactive SpecificTranscript Xq13 circa 80 geni - SRY - Geni della spermatogenesi circa 870 geni

3

4 Cromosoma Y Delezioni interstiziali dellY nel 5-10% dei soggetti con azoospermia o grave oligospermia non ostruttiva

5 Delezioni del cromosoma Y Le microdelezioni del cromosoma Y rappresentano una causa importante di sterilità maschile con oligo- azoospermia e la loro identificazione fornisce un corretto inquadramento diagnostico permette di evitare trattamenti empirici costosi e inutili ha importanti conseguenze etiche se il paziente è candidato per le tecniche di riproduzione assistita almeno 3 regioni importanti per la spermatogenesi

6 Casi di azoospermia o oligospermia severa : il 5-10% è portatore di anomalie citogenetiche del cromosoma Y il 5-10% è portatore di delezioni sub- microscopiche di Yq NON sono individuabili allanalisi del cariotipo (microdelezioni) ma possono essere identificate mediante STS-PCR STS sequence tagged sites sono sequenze note di DNA genomico che possono essere amplificate tramite PCR

7 Int J of andrology (1999) – Hum Reprod (2001) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions M.Simoni et al. elenco di STS da non utilizzare set di STS primers consigliati: AZFa:sY84,sY86 AZFb:sY127,sY134 AZFc:sY254,sY255 Se viene trovata una delezione per valutare la esatta estensione si consiglia luso di altri STS che si trovino allestremità prossimale e distale della regione (particolarmente importante per AZFa e b in pazienti candidati allICSI)

8 Multiplex a sY254 (c) sY 86 (a) sY127 (b)

9 Multiplex b sY255 (c) sY134 (b) sY84 (a)

10 Frequenza delle microdelezioni Y estema variabilità tra i vari studi (1%-55%) dipende dai criteri di selezione pazienti azoospermici o gravemente oligospermici (<5 milioni spermatozoi/ml) la percentuale è dell11% (solo le forme idiopatiche : 18%) se si considerano pazienti con più di 5 milioni di spermatozoi/ml la percentuale è inferiore all1% Casistica laboratorio Genetica Medica: 1/600 AZFa 2/600 AZFb 12/600 AZFc 6/600 AZFb+c 2/600 AZFa+b+c Tot. 23/600 (3.8%)

11 AZFa DBY - UTY USP9Y* Del interstiziale rara Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) AZFb RBMY1A (multicopia) Del interstiziale rara Arresto della spermatogenesi alla pubertà prima o durante la meiosi AZFc DAZ (4-7 copie) BPY2 CDY1 (2 copie una nel cluster DAZ una allestremo 3) Del interstiziale c comune Presenza di cellule germinali in vario stadio di maturazione ma pochi spermatozoi (periodo fertile giovanile) Del terminale c intermedia Del interstiziale bc comune Fenotipo variabile dalla SCOS alla oligospermia Del terminale abc rara Azoospermia con sole cellule si Sertoli (SCOS) Mutazioni puntiformi in USP9Y * in 2 maschi con ipospermatogenesi

12 Variabilità fenotipica delle delezioni non costante correlazione genotipo-fenotipo in genere: –azoospermia (84%) –grave oligospermia (meno di 1 x10 6 ml) (14%) –moderata oligospermia (1-5 x10 6 ml) (2%) alterazione della spermatogenesi variabile anche in delezioni apparentemente simili del Y anche in azoo- oligospermici con criptorchidismo o varicocele grave del Y può promuovere la perdita del cromosoma con mosaicismo somatico 45X / 46XY del Y molto centromeriche associate a bassa statura

13 Sex reversal

14 Inattivazione dellX solo uno dei due crom. X è attivo nelle femmine stadio di morula casuale innattivazione X pat. / X mat. propagazione clonale Zigote femminile meno di 100 cellule

15 Inattivazione bilanciata dellX Cosa succede se una donna porta un gene non funzionante sullX Zigote femminile il 50% delle cellule non esprime quel gene Innattivazione casuale X paterno / X materno gene mutato

16 Inattivazione dellX Compensa le differenze di dose genica tra maschi e femmine Alcuni geni sfuggono allinattivazione (regioni pseudo-autosomiche alle estremità del cromosoma X) I geni XIST-TSIX in Xq13 sono essenziali per linattivazione La metilazione è uno dei meccanismi dellinattivazione

17 Inattivazione sbilanciata dellX Perchè ? Un cromosoma X porta una mutazione LETALE Cè una traslocazione bilanciata X ; autosoma La regione che controlla linattivazione è alterata E avvenuto per caso

18 Inattivazione Sbilanciata dellX: effetto della selezione Zigote femminile Selezione nei tessuti in cui la funzione del gene è indispensabile Inattivazione casuale stadio embrionale gene mutato

19 Malattie X-Linked recessive Femmina Femmina Maschio Maschio SANA PORTATRICE MALATO SANO Madre ( portatrice ) Padre X X Y

20 Ereditarietà X-Linked recessiva

21

22 Distrofia Musculare di Duchenne DMD Giorgio Ester Enrico

23 Giorgio ha 3 anni modesto ritardo nelliniziare a camminare cammina con lentezza ha difficoltà a stare eretto non corre allesame obiettivo –ipertrofia dei gastrocnemi –debolezza dei muscoli prossimali Creatina Kinasi (CPK) = 10,000 ui

24 Biopsia Muscolare Controllo Normale Giorgio

25 Colorazione Ab anti-Distrofina Controllo Normale Giorgio

26 Distrofina proteina associata alla membrana : - il dominio N-terminale lega lactina - lungo dominio con 24 ripetizioni omologhe ad α-elica - una regione vicina al C-terminale ricca di cisteine che lega il calcio - il dominio C-terminale che lega altre proteine di membrana

27 Gene DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) 8 promotori79 esoni (0.6%) mRNA 14 kb trascritto in 16 ore DM Duchenne : mancata espressione di distrofina - delezioni molto grandi (65-70%), duplicazioni (10%) - mutazioni frameshift (10%), stop codon (5%) - delezione in-frame con perdita delle regioni C-terminale o N-terminale (domini che legano le proteine) DM Becker : alterata qualità o quantità di distrofina - delezioni in-frame (85%) - di cui il 46% nella regione dei spectrin repeats

28 Ricerca diretta delle delezioni nella DMD - preparazione del DNA genomico - amplificazione con PCR multiplex di 9 o più esoni - separazione dei frammenti in gel di agarosio - visualizzazione con EB e raggi UV - fotografia (o immagine digitale)

29 Giorgio è affetto da Distrofia Musculare di Duchenne Diagnosi confermata da biopsia muscolare Il test genetico non ha evidenziato delezioni ( delezioni-dupl. sono presenti nel 70% dei malati ) Giorgio ha probabilmente una mutazione puntiforme Malattia X-linked recessiva - incidenza di 1 / 3300 tasso di nuove mutazioni di / meiosi (1/3 dei casi)

30 Albero famigliare allargato dopo colloqui con la cugina Rosa e la zia Giovanna Enrico Ester Giorgio Rosa GiovannaElena

31 La cugina Rosa vuol sapere che rischio ha di avere un figlio malato Osservando la famiglia, la probabilità che Rosa sia portatrice è = 25% Ancor prima del test genetico, si può migliorare la stima del rischio ?

32 Creatina Kinasi (CPK) fuoriesce dalle membrane del muscolo danneggiato molto elevata nei maschi malati livelli elevati solo in 2/3 delle portatrici –Giovanna e Rosa hanno CPK normale

33 Stima Bayesiana del rischio Probabilità complessiva : tiene conto della probabilita a priori di essere e di non essere portatore ( appartenendo ad dato albero famigliare ) e di altri fattori che modificano queste due probabilità (prob. condizionali)

34 Zia Giovanna : ha CPK normale e due figli maschi sani CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale Giovanna Elena

35 Quale è la probabilità che Zia Giovanna sia portatrice ? Che lo sia Che non lo sia Probabilità a priori 1 / 2 1 / 2 con CPK Normale ? 1 / 3 1 con 2 figli Maschi Sani ? 1 / 4 1 Prob. condizionale 1/2.1/3.1/4 = 1 / 24 1 / 2 Prob. finale 1 : 12 1 / 24 1 / / 2 = 1 / 13

36 Cugina Rosa : ha 1/2 della probabilità di Giovanna e CPK normale CPK normale Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale Giovanna Elena

37 Il rischio a priori per Rosa è la metà di quello di Zia Giovanna 1/13 x 1/2 = 1/26

38 Quale è la probabilità che Rosa sia portatrice ? Che lo sia Che non lo sia Probabilità a priori 1/13.1/ 2 = 1 / / 26 con CPK Normale ? 1 / 3 1 Prob. a posteriori 1/26.1/3 = 1 / / 26 Prob. finale 1 : 75 1 / 78 1 / /26 = 1 / 76 Che lo sia Che non lo sia Probabilità a priori 1/13.1/ 2 = 1 / / 26 con CPK Normale ? 1 / 3 1 Prob. a posteriori 1/26.1/3 = 1 / / 26 Prob. finale 1 : 75

39 Probabilità che Rosa possa avere un figlio affetto 1/ 76 x 1/4 = 1 / 304 Prob. di essere portatrice X rischio di trasmissione

40 1/304 è la probabilità che la cugina Rosa possa avere un figlio affetto CPK normale (1/13) Enrico Ester Giorgio Rosa CPK normale (1/76) Giovanna Elena

41 Uso del Linkage nella malattia DMD ( mutazione non trovata ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena

42 Analisi di linkage Linkage = concatenazione Alleli corrispondenti a loci tra loro vicini sullo stesso cromosoma tendono ad essere trasmessi insieme (come una singola unità) durante la meiosi Gene con mutazione Allele 1 locus polimorfico A (1, 2, 3, 4) Allele 3 locus polimorfico B (1, 2, 3, 4, 5) Allele 2 Gene wt Allele 1

43 La frequenza di ricombinazione è una misura della distanza tra loci diversi : = 0.5 (50%) loci lontani = 0 (0%) loci vicinissimi = 0.02 (2%) loci vicini unità di misura = centiMorgan cM = 1 ricombinazione/100 meiosi Analisi di linkage 1 Mut 3 2 wt 1 2 Mut 3 1 wt 1

44 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) Esone 1 Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, alleli Microsatellite C Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, alleli G E N E DMD 5 3

45 Uso del Linkage: 1 marcatore (A) 5 UT ( e se ci fosse una ricombinazione tra mut. e marcatore? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena

46 Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D) ( cè stata ricombinazione tra mut. e marcatore ? ) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena

47 Uso del Linkage: 2 marcatori (A + D) Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena Sarà stata trasmessa la mutazione ad Ester ?

48 1 e 2 ricombinazioni tra marcatori mut

49 Esempio di marcatori polimorfici impiegati nel linkage della DMD 2,4 Mb (12 cMorgan) Esone 1 Esone 79 Microsatellite D: 1, 2, 3, alleli Microsatellite C Microsatellite B Microsatellite A: 1, 2, 3, alleli G E N E DMD = ricombinazioni in 1 su 5000 casi

50 Se il marito di Rosa avesse un aplotipo 4-1 ?? Enrico Ester Giorgio Rosa Giovanna Elena Nuove mutazioni / meiosi (1/3 dei casi)

51 Analisi del rischio in famiglie X-linked Informazioni dallalbero famigliare Calcolo del rischio secondo Bayes Ricerca della mutazione (test diretto) Uso del linkage (test indiretto) Attenzione alle ricombinazioni ! ( usare più marcatori… meglio se intragenici )

52 5DYS-II1.2 kb a monte dellesone 1 5-5N3introne 1 5-7n4introne 25 STR kb a valle dellesone 44 STR451.2 kb a valle dellesone 45 STR49introne 49 DMD1-2cintrone 56 DXS1214introne 62 3DYS MSesone 79 Caso negativo per delezioni e duplicazioni DMD

53 5DYS-II1.2 kb a monte dellesone 1 5-5N3introne 1 5-7n4introne 25 STR kb a valle dellesone 44 STR451.2 kb a valle dellesone 45 STR49introne 49 DMD1-2cintrone 56 DXS1214introne 62 3DYS MSesone 79 In caso di gravidanza: - villocentesi in 11 ma set - determinazione del sesso (SRY) - informativa solo la trasmissione X p

54 introne esone


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