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GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA: SPERMATIDI.

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Presentazione sul tema: "GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA: SPERMATIDI."— Transcript della presentazione:

1 GAMETI IMMATURI NELLE TECNICHE PMA: SPERMATIDI

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3 Contenuto in DNA durante la spermatogenesi

4 Classificazione degli spermatidi (Vanderzwalmen et al, 1997) spermatide maturo: spermatozoo con connessioni con le cellule del Sertoli spermatidi elongated: coda ben evidente, di lunghezza variabile spermatide elongating: coda visibile come protrusione laterale spermatide rotondo: cellula rotonda, con diametro di 7-8 micron, abbozzo dellacrosoma visibile come uno spot chiaro o scuro, o come protrusione

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7 Indicazioni Azoospermia secretiva dovuta a: ipospermatogenesi arresto maturativo incompleto allo stadio di spermatocita di I ordine arresto maturativo allo stadio di spermatide rotondo arresto maturativo incompleto allo stadio di spermatogone forme miste (Sertoli cell only syndrome incompleta e arresto maturativo)

8 ICSI con precursori degli spermatozoi ELSI (Fishel et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi allungati da cellule con un abbozzo di coda fino alle forme più mature con differenziazione completa ma unite alle cellule di Sertoli ROSI (Tesarik et al, 1995): iniezione intracitoplasmatica di spermatidi rotondi con o senza abbozzo del cappuccio acrosomiale ROSNI (Sofikitis et al, 1997): iniezione intracitoplasmatica del solo nucleo di spermatidi rotondi

9 Iniezione di spermatidi rotondi (ROSI) e di nuclei di spermatidi rotondi (ROSNI): fase sperimentale Autorespecietecnicarisultatofattore maschile Ogura et al,hamsterROSNI+ESembrionino 1993 Ogura et al,topoROSI+ESproleno 1994 Sofikitis et al,coniglioROSNIproleno 1994 Kimura e topoROSNIproleno Yanagimachi, 1995 Sofikitis et al,coniglioROSNI+ESproleno 1996 Goto et al, 1996bovinoROSIblastocistino Sofikitis et al,1996coniglioROSNI+ESno gravidanzevaricocele Sasagawa etopoROSIprolecriptorchidismo Yanagimachi,1997

10 Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (1) Autoretecnicagravidanzeabortinati cliniche Hannay et al,1995ROSNI440 Tesarik et al, 1995ROSI- eiaculato202 Fishel et al, 1995ELSI elongated101 Mansour et al, 1996ROSI101 Tanaka et al, 1996ROSI110 Araki et al, 1997ELSI elongated304 Vanderzwalmen ELSI elongated/303 et al, 1997elongating VanderzwalmenROSI101 et al, 1997

11 Iniezione di spermatidi: applicazione clinica (2) Autoretecnicagravidanzeabortinati cliniche Sofikitis et al, 1997ROSNI303 Amer et al, 1997ELSI elongated/20? elongating Sofikitis et 1998ELSI elongated202 Sofikitis et al, 1998nucleo di 101 spermatocita di II ordine Kaharaman et al,1998ELSI212 Kaharaman et al,1998ROSI110 Barak et al, 1998ROSI-eiaculato101 Barros et al, 1998ELSI301 AL-Hasani et al,1999ELSI200

12 Aspetti di laboratorio ROSIELSI cicli10860 oociti iniettati PN (%)274 (31)277 (58) gravidanze cliniche11 (11)16 (18) nati1013 % impianto6.56.1

13 Problematiche di laboratorio identificazione della cellula attivazione delloocita timing dei 2 pronuclei sviluppo embrionale

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16 Identificazione degli spermatidi rotondi TEM visualizzazione selettiva dellacrosina o della proacrosina con anticorpi monoclonali FISH per la valutazione dellaneuploidia Papanicolau Testsimplet microscopio cofocale microscopio con ottica Hoffman microscopio con contrasto di fase

17 Spermatide rotondo: criteri per lidentificazione a fresco cellula rotonda con diametro di micron (cellule più piccole) nucleo rotondo, centrale contorno liscio citoplasma uniformemente distribuito protusione laterale o spot a diversa densità ottica addossato al nucleo vitalità: resistenza allaspirazione nella micropipetta

18 Problematiche di laboratorio fertilizzazione delloocita materiale genetico (DNA + nucleoproteine) asincronia maturativa fattore attivante loocita centrosoma zigote e singamia comparsa dei 2 PN a 8-9 ore dalliniezione singamia con presenza di 1 nucleo a ore

19 Metodiche per la preparazione separazione meccanica con aghi o vetrini digestione enzimatica: –collagenasi –collagenasi + elastasi –tripsina + DNAsi

20 Rischi potenziali legati alla tecnica aumentato rischio di mosaicismo per anomalie del centrosoma aumentato rischio di iniettare materiale diploide anomalie dellimprinting legati alla patologia sottostante mutazioni genetiche legate alla sterilità anomalie numeriche e traslocazioni AZF: AZFa (Sertoli cell-only), AZFb (arresto maturativo), AZFc (Sertoli cell-only incompleta)

21 Coltura in vitro di spermatidi (Fishel et al, 1998) sopravvivenza 50% a 48 ore 0% a 96 ore maturazione 8 % con crescita completa del flagello a + 4 ore 22 % con crescita completa del flagello da +8 ore


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