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Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizione Anno/Pagine: 2001 pp. 800.

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1 Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizione Anno/Pagine: 2001 pp. 800 Euro: 99,00 REED Rob, HOLMES David, WEYERS Jonathan, JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI volume unico p.344 Euro 37,50 Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel

2 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae A)Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) B)Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1)Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2)Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3)Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4)Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5)Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6)Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7)Analisi su gel di agarosio 8)Fasi iniziali di Southern blot

3 Parte B 9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievito inoculo per la preparazione di estratti proteici 10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli estratti 11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE 13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h) 15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale

4 DNA endogeno DNA esogeno (transgeni) RNA strutturale mRNA Acidi nucleici come materiale di studio

5 lisi cellulare deproteinizzazione precipitazione Isolamento acidi nucleici

6 Metodi di lisi cellulare TecnicaApplicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi UltrasonicazioneMicroorganismi

7 Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi +etanolo (Na, NH4)isopropanolo Purificazione acidi nucleici

8

9 Protocollo artigianale Colonnine cromatografiche (kit commerciali) Isolamento DNA plasmidico

10 Protocollo artigianale Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Risospensione in TE

11 Isolamento DNA da cellule eucariotiche

12 Isolamento DNA

13 Isolamento RNA

14 Purificazione mRNA

15 Spettrofotometro Elettroforesi su gel Analisi acidi nucleici

16 Spettro di assorbimento del DNA lunghezza donda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD 260 =50 g/ml OD 260 /OD 280 =1,8-2,0

17 Clonaggio PCR Amplificazione DNA

18 Clonaggio

19 Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Scelta e preparazione del vettore Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Minipreparazione di plasmidi per verifica

20 Vettori plasmidici

21 strategie controlli Reazione di ligasi

22 Trattamento del vettore con fosfatasi G CTTAAp pAATTC G G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI G CTTAA AATTC G fosfatasi GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG

23 Clonaggio con doppia digestione GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG AAGCTT TTCGAA G CTTAA AGCTT A EcoRI AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII AAGCTT TTCGAA HindIII

24 Metodi di trasformazione dei batteri Metodo del cloruro di calcio Elettroporazione

25 Strategie di selezione nel clonaggio

26 Vettori plasmidici

27 Strategie di selezione nel clonaggio

28 Vettori di espressione

29 Vettori di espressione inducibili

30 Espressione proteine di fusione

31 PCR (polymerase chain reaction)

32 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

33 PCR da DNA genomico

34 PCR da mRNA (RT-PCR)

35 Uso dei linkers

36 Vettori dA:dT

37 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI

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