Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel

Presentazione sul tema: "Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel "— Transcript della presentazione:

1 E-mail loreni@uniroma2.it Antonella Ragnini Tel. 0872 570317
Fabrizio Loreni Tel Antonella Ragnini Tel Wilson K., Walker J.M. (a cura di) Metodologia biochimica Le bioconoscenze e le biotecnologie in laboratorio - nuova edizione Anno/Pagine: 2001 pp Euro: 99,00 REED Rob , HOLMES David , WEYERS Jonathan , JONES Allan METODOLOGIE DI BASE PER LE SCIENZE BIOMOLECOLARI volume unico p.344 Euro 37,50

2 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio
Studio della localizzazione intracellulare della proteina SEC4 del lievito Saccaromyces cerevisiae Clonaggio di SEC4 in vettore per l'espressione in lievito di proteine di fusione con "tag" (GFP) Espressione di SEC4 in lievito e analisi della sua localizzazione mediante western blot di estratti frazionati Parte A 1) Isolamento di DNA genomico da lievito (I parte) 2) Isolamento di DNA genomico da lievito (II parte) Analisi spettrofotometrica del DNA preparato PCR su DNA genomico (preparazione frammento da clonare) 3) Preparazione di DNA plasmidico (vettore di clonaggio) con colonnina Digestione DNA (vettore e frammento) con enzimi di restrizione 4) Analisi su gel di agarosio Reazione con enzima "ligasi" 5) Preparazione piastre di agar Trasformazione batterica 6) Analisi risultati trasformazione Minipreparazione DNA plasmidico 7) Analisi su gel di agarosio 8) Fasi iniziali di Southern blot

3 Parte B 9) Trasformazione con plasmidi ricombinanti di cellule di lievito inoculo per la preparazione di estratti proteici 10) Controllo trasformazione Preparazione degli estratti con glass beads e TCA. Frazionamento degli estratti 11-12) Bradford analysis e preparazione SDS-PAGE 13-14) Caricamento, corsa e Westernblotting (4h) 15-16) Immunodetection ECL. Discussione generale

4 Acidi nucleici come materiale di studio
DNA endogeno DNA esogeno (transgeni) RNA strutturale mRNA

5 Isolamento acidi nucleici
lisi cellulare deproteinizzazione precipitazione

6 Metodi di lisi cellulare
Tecnica Applicazione Metodi non meccanici Shock osmotico Tessuti animali molli, alcune cellule vegetali Congelamento/scongelamento Tessuti animali molli, alcuni batteri Enzimi litici Cellule animali e vegetali Metodi meccanici Pestello e mortaio Tessuti resistenti Sfere di vetro Batteri e funghi Omogenizzatore a motore Tessuti vegetali e animali Omogenizzatore a mano Tessuti molli delicati Estrusione solida (Hughes press) Materiale vegetale resistente Estrusione liquida (French press) Microorganismi Ultrasonicazione

7 Purificazione acidi nucleici
Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo

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9 Isolamento DNA plasmidico
Protocollo “artigianale” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

10 Protocollo artigianale
Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

11 Isolamento DNA da cellule eucariotiche

12 Isolamento DNA

13 Isolamento RNA

14 Purificazione mRNA

15 Analisi acidi nucleici
Spettrofotometro Elettroforesi su gel

16 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0 Spettro di assorbimento del DNA
220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

17 Amplificazione DNA Clonaggio PCR

18 Clonaggio

19 Il clonaggio di un frammento di DNA
richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore (ligasi) Introduzione nella cellula ospite Selezione Minipreparazione di plasmidi per verifica

20 Vettori plasmidici

21 Reazione di ligasi strategie controlli

22 Trattamento del vettore con fosfatasi
 G CTTAAp pAATTC  G CTTAA AATTC fosfatasi  G AATTC CTTAApG GpAATTC CTTAA G DNA ligasi pAATTC G CTTAAp EcoRI  GAATTC CTTAAG

23 Clonaggio con doppia digestione
EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA  G CTTAA AGCTT A  AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG DNA ligasi AATTC G A TTCGA EcoRI HindIII  GAATTC CTTAAG  AAGCTT TTCGAA

24 Metodi di trasformazione dei batteri
Metodo del cloruro di calcio Elettroporazione

25 Strategie di selezione nel clonaggio

26 Vettori plasmidici

27 Strategie di selezione nel clonaggio

28 Vettori di espressione

29 Vettori di espressione inducibili

30 Espressione proteine di fusione

31 PCR (polymerase chain reaction)

32 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

33 PCR da DNA genomico

34 PCR da mRNA (RT-PCR)

35 Uso dei “linkers”

36 Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

37 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI

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