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Sistemi per omogeneizzare e frazionare tessuti e cellule Per poter essere studiati in dettaglio le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari.

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Presentazione sul tema: "Sistemi per omogeneizzare e frazionare tessuti e cellule Per poter essere studiati in dettaglio le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari."— Transcript della presentazione:

1 Sistemi per omogeneizzare e frazionare tessuti e cellule Per poter essere studiati in dettaglio le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari devono essere isolati dal materiale di partenza. IL primo passaggio consiste nella distruzione della struttura cellulare o dei tessuti.

2 Coltura cellulare o tessuto

3 1-Scelta del materiale di partenza 2-Metodo di rottura delle cellule 3-Proprietà chimico-fisiche delle soluzioni impiegate.

4 Metodi per rompere le cellule -metodi blandi: lisi per osmosi digestione enzimatica solubilizzazione chimica omogenizzatori -metodi moderati omogenizzatori a lama mortaio -metodi vigorosi French press Sonicazione Macinazione con microsfere

5 Na +, Ca 2+ Le cellule animali riescono a man- tenere costante la concentrazione intracellulare di soluti scambiando attivamente (consumo di ATP) ioni con lesterno. K + Mg 2+ Shock osmotico Un abbassamento drastico della pressio- ne osmotica esterna (immersione in acqua distillata) provoca un rigonfiamento delle cellule ed una esplosione delle membrane. Lisi per osmosi METODI BLANDI

6 Lisi della parete+ shock osmotico Digestione enzimatica Sodio dodecil solfato Solubilizzazione chimica Omogeneizzazione con potter

7 Omogeneizzatori con lama (frullatore) Macinazione con mortaio METODI MODERATI

8 Camera di compressione Valvola a spillo Pistone SONICAZIONE (ultrasuoni) French press METODI VIGOROSI

9 SOLUZIONI Il tampone ideale deve possedere le seguenti qualità: –Tamponare a pH vicino alla neutralità –Essere altamente solubile. –Non penetrare attraverso le membrane (se si studiano organelli). –Essere stabile chimicamente ed enzimaticamente –Non assorbire luce nelle regioni dello spettro UV- visibile –Non essere tossico.

10 Acido acetico4.75È efficace come tampone solo a pH acidi (4-5.5). Acido citrico4.76 (pK a2 ) 6.4 (pK a3 ) È efficace come tampone a pH <7. Tende a chelare gli ioni polivalenti. MES acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico 6.1È uno dei cosiddetti Good buffers (dal nome di chi ne ha esplorato luso in biochimica e biologia cellulare), come anche Bicina, PIPES, HEPES ed altri. Poco tossico per le cellule. Acido carbonico6.35 (pK a1 ) 10.3 (pK a2 ) La forma diprotonata tende a formare CO 2. Più utile come tampone per la biochimica, a pH alcalini, lo ione monoacido. PIPES acido 1,4piperazinodietansulfonico 6.8Relativamente costoso, ma valido. Interagisce pochissimo con i metalli divalenti (Ca 2+, Mg 2+, Mn 2+ ). Può interferire con il metodo di Lowry per la determinazione della concentrazione proteica. Imidazolo7.0 Acido fosforico7.2 (pK a2 ) 12.3 (pK a3 ) Poco costoso. È spesso metabolita o inibitore di sistemi enzimatici. Tende a precipitare i cationi polivalenti. HEPES acido N-2-idrossietil-piperazina-N-2- etansulfonico 7.5Vedi PIPES. Tris Tris(idrossimetil)aminometano 8.1Poco costoso e molto usato. Tuttavia può dare effetti inibitori con molti sistemi enzimatici ed interagire fortemente con I metalli di transizione. Il suo pK a varia sensibilmente con la temperatura Bicina N,N-bis-(2-idrossietil)glicina 8.35Un Good buffer. Acido borico 9.2Forma complessi con gli acidi nucleici. Glicina 9.8 (pK a2 ) ACIDO O BASEpKnote

11 Ioni Mg2 Composti tiolici (2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo, glutatione, cisteina…) vengono utilizzati per mantenere ridotti i gruppi sulfidrilici delle proteine essenziali). Inibitori di proteasi.. Per gli acidi nucleici, RNA in particolare, occorrerà usare degli inibitori di nucleasi (RNAsina, cocktails di anticorpi specifici per le ribonucleasi, vanadil nucleotidi…). ALTRI COMPONENTI DEL MEDIUM


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