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STUDIO DELLE PROTEINE. cromatografia.

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Presentazione sul tema: "STUDIO DELLE PROTEINE. cromatografia."— Transcript della presentazione:

1 STUDIO DELLE PROTEINE

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4 cromatografia

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11 Frazionamento Metodi non meccanici: :

12 centrifugazione

13 Chiarificazione dellestratto Lestratto grezzo deve essere pulito prima di procedere al frazionamento Conviene allontanare subito gli acidi nucleici, ribosomi mediante precipitazione (protamina solfato) Nel caso contiene molto materiale insolubile si può centrifugare Molto efficaci sono le tecniche che sfruttano la diversa solubilità delle singole proteine

14 Solubilità differenziale Sviluppo passaggi di purificazione = 1/2 c i Z 2 i

15 Punto isoelettrico Calore Precipitazione frazionata con Sali (salting-in/salting out) Solventi organici Con polimeri organici (PEG) pH estremi METODI DI PRECIPITAZIONE DELLE PROTEINE

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17 Esempio di precipitazione frazionata

18 Sviluppo di passaggi cromatografici Per stabilire la tecncica cromatografia più utile per la nostra proteina bisogna tenere conto di alcuni parametri generali: -la capacità e la resa del processo cromatografico; -la diluizione della proteina nel passaggio cromatografico; -la velocità, -la conservazione dellattività durante il passaggio; -il costo dellintero processo. Criterio generale: assemblare una serie di passaggi che separano le proteina secondo proprietà diverse.

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20 Concentrazione per ultrafiltrazione e conservazione La concentrazione si realizza forzando acqua e piccole molecole attraverso una membrana semipermeabile usando alta pressione o centrifugazione. Sono disponibili commercialmente diverse membrane con intervallo di peso molecolare tra 500 e (Amcon, Millipore) con dimensioni di pori 0,1-10 mm. Le proteine purificate in genere vengono conservate a basse temperature (-80°C). Spesso si aggiungo agenti criogeni (glicerolo, glicole etilenico, DMSO) per stabilizzare la proteina durante il congelamento e scongelamento.

21 Dialisi


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