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La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina richiede la possibilità di: 1. Identificare e quantizzare la proteina.

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1 La messa a punto di un procedimento sperimentale di purificazione di una proteina richiede la possibilità di: 1. Identificare e quantizzare la proteina di interesse fra tutte le altre proteine del campione di partenza (gli ENZIMI possono essere identificati sulla base della reazione che essi catalizzano tramite un opportuno SAGGIO ENZIMATICO) 2. Misurare la quantità di proteine totali nel campione 3. Valutare la presenza di proteine contaminanti nel campione di interesse

2 mg o U di prot. di interesse nella frazione mg o U di prot. di interesse allinizio della purificazione Resa Resa = U di proteina di interesse nella frazione mg di protine totali nella frazione AsAsAsAs = proteine totali (mg) Enzima (mg) Resa % Purezza (%) U totaliA s (U/mg) Omogenato %10% ° stadio purificazione ° stadio purificazione ° stadio purificazione 1980 Saggiocolorimetrico Stima da SDS-PAGE Valore ipotetico proteina pura = 100 U/mg Saggio di attività enzimatica

3 Tale termine descrive la migrazione di particelle cariche sotto linfluenza di un campo elettrico Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili e, quindi, ad un opportuno valore di pH sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche Sotto linfluenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso il catodo o lanodo, a seconda che possiedano una carica positiva (cationi) o negativa (anioni)

4 Lelettroforesi è dunque il processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa delle loro diverse mobilità I fattori che influenzano la mobilità di una molecola in un campo elettrico comprendono la carica della molecola (q), il gradiente di voltaggio del campo elettrico (E), la resistenza di attrito del mezzo di supporto (f) Il prodotto dei parametri q ed E (q x E) fornisce la forza, misurata in newton, che spinge una molecola di carica q verso un elettrodo di carica opposta La forza frizionale f, la quale rallenta il movimento della molecola carica, dipende dalle dimensioni della molecola, dalla sua forma, dalle dimensioni dei pori del mezzo nel quale avviene lelettroforesi e dalla viscosità del tampone La velocità (v) di una molecola carica che si sposta in un campo elettrico è data dunque dalla seguente equazione: v Eq f f

5 Comunemente è adoperato il termine mobilità elettroforetica (μ) dello ione, che equivale alla velocità dello ione diviso lintensità del campo elettrico (v/E) Quando si applica una differenza di potenziale, molecole con carica elettrica totale differente inizieranno a separarsi in funzione della loro mobilità elettroforetica Anche molecole con carica elettrica uguale, ma con dimensioni molecolari differenti, si separeranno per effetto di forze frizionali diverse Se il campo elettrico è rimosso prima che le varie molecole cariche abbiano raggiunto gli elettrodi, si ha una separazione dei singoli componenti in base alla loro mobilità elettroforetica Una volta terminata la separazione dei campioni, questi sono visualizzati mediante opportuni metodi di colorazione

6 Elettroforesi Velocità di migrazione Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA Inversamente proporzionale alle DIMENSIONI MOLECOLARI catodo anodo

7 Elettroforesi Velocità di migrazione Direttamente proporzionale al rapporto CARICA / MASSA CARICA / MASSA

8 Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto

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10 Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole che devono essere separate

11 Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto Aggiunta del Fissativo

12 Gli studi pionieristici sullelettroforesi furono condotti in soluzione libera Apparve subito chiaro che i problemi associati a questa metodica, in particolar modo gli effetti negativi della diffusione, potevano essere limitati stabilizzando il mezzo in cui avviene lelettroforesi Ciò fu realizzato facendo avvenire lelettroforesi su un supporto meccanico poroso, il quale veniva opportunamente bagnato nel tampone di corsa ed allinterno del quale si realizzava lelettroforesi degli ioni del tampone e del campione Un mezzo di supporto ideale dovrebbe essere idrofilico (al fine di impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il impedire interazioni idrofobiche tra le molecole del campione ed il mezzo di supporto), privo di carica e stabile in un ampio intervallo di temperatura, pH e osmolarità e dovrebbe avere una porosità di temperatura, pH e osmolarità e dovrebbe avere una porosità controllata e regolabile in modo preciso controllata e regolabile in modo preciso Oggi per la maggior parte delle tecniche elettroforetiche si adoperano gel di poliacrilammide o di agarosio

13 Le dimensioni dei pori del mezzo di supporto sono importanti perché contribuiscono al coefficiente di attrito (f) Leffetto di setaccio del mezzo di supporto, insieme al rapporto carica/massa delle molecole, contribuisce a rapporto carica/massa delle molecole, contribuisce a determinare la separazione delle molecole del campione determinare la separazione delle molecole del campione

14 COMPONENTI PRINCIPALI Alimentatore Cella elettroforetica 1. Per elettroforesi su gel verticale 2. Per elettroforesi su gel orizzontale Se durante una elettroforesi è applicato un voltaggio costante, lintensità di corrente, per effetto della diminuzione della resistenza, aumenta, determinando un aumento del calore sviluppato (si veda la legge di Ohm: V/I=R). Per tale motivo si utilizzano alimentatori in grado di fornire una corrente costante. In questo modo si eliminano le fluttuazioni di calore.

15 Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) Quando sono poste in un campo elettrico le proteine migreranno verso lelettrodo di carica opposta lelettrodo di carica opposta Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nellintervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pI<8 maggioranza di esse ha un pI<8 Ne consegue che ad un pH pari ad 8 o maggiore la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migrerà in un campo elettrico proteine ha una carica netta negativa e migrerà in un campo elettrico verso lanodo (elettrodo positivo) verso lanodo (elettrodo positivo) La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecole proteiche è lelettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE)

16 La separazione delle molecole cariche sottoposte al campo elettrico si basa essenzialmente sulleffetto setaccio LSDS-PAGE consente la separazione di molecole con un rapporto carica/massa identico, ma di dimensioni molecolari diverse molecolari diverse NellSDS-PAGE la matrice del gel è una sostanza reticolata che agisce come un setaccio, in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilità elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensioni

17 Costituisce il mezzo di supporto di scelta per quasi tutte le applicazioni dellelettroforesi di proteine e di molte applicazioni dellelettroforesi di acidi nucleici Lacrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel La porosità del gel di poliacrilammide può essere regolata variando la percentuale di acrilammide e/o il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammide Lacrilammide allo stato liquido è una potente neurotossina. Pertanto assicuratevi di indossare i guanti in tutte le operazioni che prevedono lutilizzo di acrilammide. Quando pesate o utilizzate la polvere, indossate una maschera. Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminate. Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossici. Una volta polimerizzata lacrilammide perde tossicità.

18 I gel di poliacrilammide sono preparati facendo copolimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N-metilene bisacrilammide (bis-acrilamide). La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati (cross-linking agent). I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide. In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per lestensione. Ciò fa sì che si formi una matrice con dei legami crociati a struttura ben definita. Acrilammide Bis-acrilammide

19 Il processo di polimerizzazione dellacrilammide è un tipico esempio di catalisi radicalica ed inizia con laggiunta di ammonio persolfato e della base N,N,N,N-tetrametilendiammina (TEMED). Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato con la produzione del corrispondente radicale libero (cioè una molecola con un elettrone spaiato), nel modo seguente: Se rappresentiamo il radicale libero con R· ed il monomero di acrilammide con M, possiamo schematizzare la polimerizzazione nel modo seguente: R· + M RM· RM· + M RMM· RMM· + M RMMM· ecc. TEMED (iniziatore) Lammonio persolfato è lestere disolfato dellacqua ossigenata e omolisa rapidamente a radicali instabili (radicali solforici). Il TEMED è unammina terziaria che reagisce con questi radicali a formare radicali liberi TEMED, che a loro volta reagiscono con lacrilammide inducendone la polimerizzazione.

20 In questo modo si formano lunghe catene di acrilammide tenute insieme tra loro da legami crociati derivanti dallinserzione occasionale allinterno della catena di molecole di bis-acrilammide. Dal momento che lossigeno rimuove i radicali liberi dalla soluzione, tutte le soluzioni per la preparazione del gel sono degassate prima delluso. Le soluzioni sono poste in beute da vuoto e poste per breve tempo sotto vuoto per allontanare lossigeno disciolto. GEL DI POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => trattiene grosse quantità di acqua) Acrilammidebis-acrilammide TEMED (iniziatore) (catalizzatore)

21 E un metodo alternativo per la polimerizzazione dei gel di acrilammide. In questo caso al posto dellammonio persolfato e del TEMED si utilizza riboflavina. La soluzione è illuminata per 2 o 3 ore con una luce intensa. La conseguente fotodecomposizione della riboflavina produce radicali liberi che danno inizio alla polimerizzazione del gel.

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24 Le dimensioni medie dei pori in un gel di poliacrilammide possono essere controllate variando la quantità di monomero (acrilammide) o aumentando il grado di legami trasversali per ottenere pori più stretti. In genere il grado di legami trasversali è mantenuto costante, mentre si varia la percentuale di acrilammide per ottenere gel di differente porosità. Per un gel di una data composizione si avrà una distribuzione statistica di dimensioni dei pori. Proteine relativamente piccole migreranno nel gel con un impedimento minimo, mentre la migrazione delle proteine di dimensioni maggiori sarà ritardata. In ogni dato gel saranno dunque separate solo le proteine che sono in un particolare ambito di dimensioni

25 Percentuale di acrilammide Ambito ottimale di dimensioni molecolari (Da) >15< N.B.: la percentuale di bis-acrilammide è fissa e corrisponde a circa il 5% dellacrilammide. dellacrilammide.

26 Per semplificare lanalisi di miscele di proteine è possibile fare in modo che la separazione elettroforetica si basi solo sulle dimensioni delle catene polipeptidiche. Ciò si ottiene denaturando le proteine con il detergente Sodio Dodecil Solfato (SDS). Tale detergente si lega con forza alle proteine, le quali si ripiegano a formare delle bacchette estese rivestite di SDS. In media, ogni due amminoacidi sarà presente una molecola di SDS. Poiché ciascuna molecola di SDS ha due cariche negative ai valori di pH adoperati per lelettroforesi, la carica netta delle catene polipeptidiche rivestite sarà molto più negativa di quella delle catene non rivestite. Inoltre il rapporto carica/massa sarà essenzialmente identico per proteine diverse, dal momento che il rivestimento di SDS domina la carica. La separazione delle catene polipeptidiche denaturate e rivestite di detergente si baserà quasi esclusivamente sulle dimensioni delle molecole proteiche

27 proteina Sodio Dodecil Solfato CH 3 (CH 2 ) 10 CH 2 OSO 3 - Na +

28 Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è Per ottenere una buona separazione di proteine diverse in una miscela è essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli essenziale che le proteine siano applicate sul gel in volumi molto piccoli La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è La parte superiore del gel di poliacrilammide, nota come stacking gel, è versata direttamente al di sopra del resolving gel versata direttamente al di sopra del resolving gel Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle Lo stacking gel ha delle proprietà che consentono la concentrazione delle proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel proteine del campione in una zona sottile al di sopra del resolving gel In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving In tal modo le proteine rivestite da SDS sono separate nel resolving gel in maniera efficace e riproducibile gel in maniera efficace e riproducibile Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di Lo stacking gel è polimerizzato con una piccola percentuale di acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare unalta porosità, ed è acrilammide e di bis-acrilammide, per assicurare unalta porosità, ed è tamponato con tampone Tris-HCl a pH 6,8 tamponato con tampone Tris-HCl a pH 6,8 Il resolving gel contiene invece una percentuale più alta di Il resolving gel contiene invece una percentuale più alta di acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a pH 8,8 acrilammide ed è tamponato con Tris-HCl a pH 8,8 Il tampone di corsa contiene Tris a pH 8,3 con glicina come controione Il tampone di corsa contiene Tris a pH 8,3 con glicina come controione

29 Quando la glicina del tampone di corsa entra nello stacking gel a pH 6,8 sarà principalmente nella sua forma zwitterionica neutra, con una piccola frazione (1%) in forma di ione glicinato carico negativamente Ciò impedisce alla glicina di essere un trasportatore efficiente di corrente Gli ioni Cl - restano trasportatori efficienti di corrente a pH 6,8 e migrano rapidamente verso lanodo Durante questa elettroforesi nello stacking gel, la concentrazione degli ioni Cl - scende drasticamente allestremità catodica del gel, formando un gradiente crescente di concentrazione verso lanodo Le molecole proteiche rivestite di SDS ed il colorante, i quali hanno rapporti carica/massa maggiori di quello della glicina ma minori di quello del Cl -, devono adesso migrare per portare la corrente di elettroforesi dietro gli ioni Cl - e davanti alla glicina A mano a mano che procede lelettroforesi, le molecole proteiche che raggiungono il resolving gel sono ritardate notevolmente, consentendo alle molecole proteiche che le seguono di raggiungerle Il volume del campione di proteine presentato al gel di risoluzione sarà molto più piccolo del volume caricato inizialmente sullo stacking gel

30 Quando viene applicata la corrente, tutte le specie ioniche presenti devono migrare alla stessa velocità altrimenti si verifica una interruzione nel circuito elettrico. Perché ciò avvenga è necessario che gli ioni glicinato, più lenti, siano soggetti ad un campo elettrico più intenso rispetto agli ioni Cl - più veloci. Il campo elettrico è inversamente proporzionale alla conduttività, la quale a sua volta è proporzionale alla concentrazione dello ione che conduce corrente. Il risultato è che le tre specie ioniche tendono a variare la propria concentrazione in modo che gli ioni Cl - siano più concentrati dei complessi SDS-proteina, i quali, a loro volta, siano più concentrati del glicinato. Dal momento che la quantità di complessi SDS-proteina è molto inferiore alla quantità di ioni glicinato, questi complessi tendono a concentrarsi in una banda molto sottile tra il glicinato e gli ioni Cl -.

31 Quando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del pH più altoQuando il glicinato raggiunge il gel di separazione, per effetto del pH più alto (6,8 nello stacking gel e 8,8 nel resolving gel), diviene completamente ionizzato e quindi aumenta la propria mobilità Dunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl - migrano piùDunque nel gel di separazione gli ioni glicinato e gli ioni Cl - migrano più velocemente rispetto ai complessi SDS-proteina, i quali migrano in maniera inversamente proporzionale alle loro dimensioni molecolari La separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti diLa separazione dei complessi SDS-proteina avviene infatti in base agli effetti di setaccio molecolare dovuti alle dimensioni dei pori del gel Le proteine più piccole passano più facilmente allinterno dei pori del gel, mentreLe proteine più piccole passano più facilmente allinterno dei pori del gel, mentre le proteine di dimensioni maggiori sono ritardate dalle forze frizionali


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