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PH10pH3 Parma, 8 Novembre 2001 step1 proteine acide proteine basiche +anodo 3500 V La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF) v=E·z·f -1 v = velocità

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1 pH10pH3 Parma, 8 Novembre 2001 step1 proteine acide proteine basiche +anodo 3500 V La prima dimensione : Isoelectric focusing (IEF) v=E·z·f -1 v = velocità di migrazione della proteina in un campo elettrico E = forza del campo elettrico z = carica netta della proteina f = coefficiente frizionale = 6 r = viscosità del mezzo pI, punto isoelettrico Z=Ø v= Ø -catodo Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MALDI-TOF MS ESI MS/MS Tot 76 kVh - step2 + -step3 + +

2 La I° dimensione : IPG strips Una I° dimensione eccellente assicura che gli spots (peptidi) siano ben separati (= risolti) nella II° dimensione, anche quando una grande quantità di proteine viene analizzata Perché la I° dimensione è così importante nella 2-DE ? I° dimensione : limportanza Parma, 8 Novembre 2001 Sample preparation First dimension Second dimension Detection Image Analysis MS analysis I mmobilized P H G radient strip = IPG strip Perché le IPG strips sono così importanti nella I° dimensione ? 1. il gradiente di pH immobilizzato è stabile ed evita il fenomento della catodic drift ; 2. se sono noti i valori di pI delle proteine dinteresse, lintervallo di separazione IEF viene ristretto e ne consegue unanalisi estremamente mirata (>accuratezza e precisione) ; 3. elevata risoluzione proteica ; 4. alta riproducibilità dei risultati ; 5. le proteine estremamente acide o basiche sono più facilmente separabili ; 6. IPG buffers con stesso intervallo di pH delle IPG strips sono disponibili e il loro utilizzo fa notevolmente ridurre o elimina il background nella colorazione del gel ….

3 La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE Nella II° dimensione in condizioni denaturanti (elettroforesi monodimensionale SDS-PAGE) le proteine sono separate in un gel di poliacrilamide in base alla loro massa molecolare ( MM ) H 3 C-(CH 2 ) 10 -CH 2 OSO 3 - Na + Sodio dodecil solfato (SDS) = detergente anionico che spezza tutte le interazioni non covalenti delle proteine native + Mercaptoetanolo e ditiotreitolo = riducono i ponti disolfuro Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodo - allanodo + in base alla loro MM Sottoposte ad un C.E. le proteine migrano dal catodo - allanodo + in base alla loro MM I° dimensione : limportanza Parma, 8 Novembre 2001 La miscela proteica è sottoposta a : 1. I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa MM proteica I complessi SDS-proteina denaturata hanno una carica negativa MM proteica3. Gli anioni dellSDS si legano alle catene principali in un rapporto di : ~ 1 molecola SDS 2 residui di amminoacidi 2.

4 La seconda dimensione : 2D SDS-PAGE - CATODO + ANODO 45 mA - + IPG strip Gel di poliacrilamide

5 t Giorno Equilibrazione 9.30 Giorno 2 Reidratazione o.n. Separazione IEF Giorno 3 Preparazione 2°dimensione Equilibrazione Preparazione 2° dimensione (GELS) Separazione 2D-PAGE Preparazione 2° dimensione Giorno 4 Giorno 5 Fissazione e colorazione Sistemi di analisi 2DE - strumenti Multiphor II (APB) I° DIMENSIONE (IEF) : 12 IPG strips / corsa II° DIMENSIONE (2D-PAGE) : Hoefer DALT unit (APB) Hoefer DALT unit (APB) 10 gels / ore Ettan DALT II System (APB) Ettan DALT II System (APB) 12 gels / 4-6 ore IPG Phor (APB) 12 IPG strips / corsa Analisi 2DE : le apparecchiature Parma, 8 Novembre 2001

6 Vantaggi Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine) Riproducibiltà e affidabilità dei risultati Riproducibiltà e affidabilità dei risultati Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteinefosforilazioneglicosilazione, tagli proteolitici, Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare Identificazione MIRATA di uno specifico pattern proteico cellulare 2DEVantaggiSvantaggi 2DE : vantaggi vs svantaggi Parma, 8 Novembre 2001 Vantaggi vs vantaggi

7 2DEVantaggiSvantaggi Svantaggi metodica lunga metodica lunga molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisica molto dispendiosa in termini di : tempo, costo, fatica fisica bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche bassa capacità di risoluzione delle proteine idrofobiche difficile separazione delle proteine molto acide o basiche difficile separazione delle proteine molto acide o basiche scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDa scarsa risoluzione di proteine con MM > 150 kDa bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico bassa risoluzione delle proteine poco rappresentative nel campione proteico mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel mancanza di linearità o sensibilità tra abbondanza della proteina nel campione proteico e capacità di risoluzione tramite colorazione sul gel Parma, 8 Novembre DE : vantaggi vs svantaggi Vantaggi vs Svantaggi


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