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Metodi post-genomici in biochimica cellulare. Metodi post-genomici.

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Presentazione sul tema: "Metodi post-genomici in biochimica cellulare. Metodi post-genomici."— Transcript della presentazione:

1 Metodi post-genomici in biochimica cellulare

2 Metodi post-genomici

3 Quantitative analysis of systems biology by taking advantage of available genomic information at the level of 1.SNPs analysis associated to disease or drug response 2.mRNA (transcriptomics) 3.Protein (proteomics) 4.Post-translational modifications (aka modificomics) 5.Surface exposure (surfomics) 6.Protein-protein interactions (interactomics) n 7.Small metabolites (metabolomics) and their relations (metabonomics) Many other fantasy exercises (glycomics, lipidomics, allergenomics, degradomics, excluding – perhaps – comics...) G.B Smejkal, Im an –omics, youre an -omics... Exp. Rev. Proteomics 3 (2006) Metodi post-genomici

4 Modelli cellulari e animali Trascrittomica Proteomica Systems biology

5 Modelli cellulari e animali (farmacologici e/o genetici)

6 Modelli cellulari (farmacologici e/o genetici) Facilità di mantenimento e trattamento Possibilità di combinare trattamento farmacologico e manipolazione genetica Utili per riprodurre un singolo meccanismo Cellule umane (o murine)

7 Modelli animali (farmacologici) Intero organismo vs. cellule isolate Trattamento sistemico o lesione chimica locale Possibilità di valutare leffetto anterogrado/retrogrado

8 Modelli animali (e vegetali?!?) (genetici) Organismi modello Genoma noto Non solo topo! Vita breve Invertebrati (e piante…)

9 Trascrittomica

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13 Distanza Euclidea Correlazione di Pearson

14 Proteomica Non cè correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999) Il proteoma è unistantanea del fenotipo a livello biochimico Il proteoma tiene conto del processing delle proteine S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19, 1720 (1999)

15 Proteomica Metodi basati su 2-DE Metodi gel-free

16 Proteomica (2-DE) Principi della 2-D elettroforesi I dimensione Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico II dimensione SDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare

17 Proteomica (2-DE) Vantaggi Possibilità di caricare campioni non purificati Risoluzione estremamente alta I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti Proteine sono protette allinterno della matrice del gel Problematiche Gradiente di pH Limiti nel determinare proteine poco rappresentate Capacità di caricare campione Proteine idrofobiche Proteine ad alto peso molecolare

18 Proteomica (2-DE) A global, unbiased approach Hypothesis-generating rather than hypothesis-driven A find the difference game between two conditions ControlTreated

19 Proteomica (2-DE)

20 Proteine Colorazione Acquisizione Analisi di immagine

21 Proteomica (2-DE) Find the difference… Controllo Esordio Precoce Esordio Tardivo

22 Proteomica (2-DE) Find the difference…

23 Proteomica (2-DE) Metodi statistici

24 Proteomica (2-DE) Peptide mass fingerprinting LC-MS/MS Western blot (non globale) Identificazione delle proteine

25 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting

26 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting

27 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting (Limiti) La proteina non è presente nel database La proteina è ricca di modificazioni co/post- traduzionali Lo spot nasconde più di una proteina

28 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting (Limiti) La proteina non è presente nel database La proteina è ricca di modificazioni co/post- traduzionali Lo spot nasconde più di una proteina

29 Proteomica (2-DE) LC-MS/MS

30 Proteomica (gel-free) Metodi quantitativi (ICAT, iTRAQ, …) Protein arrays

31 Proteomica (gel-free) ICAT

32 Proteomica (gel-free) iTRAQ

33 Proteomica (gel-free) Protein arrays (e SELDI)

34 Systems Biology Necessità di analizzare un elevato numero di informazioni (Network analysis) Necessità di arricchire un ridotto numero di informazioni (Network enrichment)

35 Systems Biology Interazione fisica Stesso pathway (KEGG) Stessa Gene Ontology (GO)

36 Systems Biology

37 Un esempio (realizzato a Busto…)

38 Quali condizioni? Trova le differenze! Cosa hanno in comune? Un nuovo bersaglio! Il Modello 38 Un modello cellulare per identificare nuovi meccanismi e nuovi bersagli terapeutici

39 Il modello cellulare La linea cellulare umana SH-SY5Y incamera dopamina, ma la immagazzina con difficoltà nelle vescicole La linea viene trasfettata stabilmente per esprimere α-sinucleina or β-galattosidasi Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson α-sinucleina (Gómez-Santos et al., 2003) I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson 39

40 Le condizioni sperimentali Controllo NON trattate Controllo trattate con Dopamina α-Sinucleina NON trattate α-Sinucleina trattate con Dopamina -Sinucleina Dopamina Effetto combinato 40

41 Trova la differenza! 41

42 Trova la differenza! Dopamina 11 α-Sinucleina 4 Entrambi i fattori 8 sintesi proteica mitocondri stress ossidativo citoscheletro trascrizione mitocondri trasduzione del segnale 42

43 Cosa hanno in comune? Dopaminaα-Sinucleina Entrambi i fattori 43

44 Generare nuove ipotesi NF-κB Apoptosi 44

45 Ritorno al modello VDAC2 4h ctr ctr inib DA inib DA Inibitore GSK3β 45 Alberio, Fasano, Rizzuto e altri, in preparazione VDAC2 CtrDA VDAC1VDAC2VDAC3 CtrDACtrDACtrDA

46 Partendo dal modello cellulare, verso nuovi bersagli terapeutici Alterazione della Dopamina Proteine che cambiano NF-κB, i VDACs, GSK3β. Nuove terapie? 46


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