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Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo

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Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Biologia Molecolare II Michela A. Denti

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Presentazione sul tema: "Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo"— Transcript della presentazione:

1 Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot Seminario Metodologico per il Corso di Didattica Libera Marilena Dinardo

2 Le proteine sono il prodotto dei geni: sono le proteine che servono a fabbricare un organismo, a farlo funzionare e, quando sono difettose, si rendono responsabili di malattie. Ed è proprio attraverso lo studio del funzionamento delle proteine che si potrebbe arrivare alla costruzione di nuovi farmaci….

3 Purificazione delle proteine: La purificazione di una proteina costituisce il primo passaggio nello studio delle sue proprietà. Una proteina, per poter essere purificata, deve dapprima essere estratta dalla sua matrice biologica e poi allontanata selettivamente dalle altre proteine.

4 La procedura adottata per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.

5 La rottura delle cellule può essere ottenuta mediante: Digestione enzimatica della parete o della membrana plasmatica mediante appropriate miscele di cellulasi, lipasi e proteasi (tripsina, collagenasi, ialuronidasi); Shock osmotico; Successivi cicli di congelamento/scongelamento; Generalmente devono però essere applicati metodi più energici, che sottopongono le cellule a stress meccanici. I metodi di rottura meccanici sono fondamentalmente di due tipi: mediante forze frizionali tra cellule e materiale solido; mediante forze frizionali in sospensione di cellule.

6 Gli omogeneizzatori sono costituiti da un tubo di vetro e da un pestello mosso a mano (Dounce o Tenbrock) o elettronicamente (Potter- Elvejham). Il tubo è mantenuto fisso mentre il pestello viene fatto ruotare per generare le forze frizionali, le quali sono più elevate alla superficie del pestello e minime lungo la parete del tubo. Lo spazio libero tra il pestello e la parete del tubo è mantenuta entro dimensioni precise in quanto lattrito sviluppato dipende dal raggio del pestello e del tubo di vetro e dalla velocità di rotazione del pestello stesso.

7 Le procedure utilizzate per ottenere un estratto proteico grezzo sono estremamente semplici e richiedono: - la rottura delle cellule in uno specifico buffer; - la centrifugazione del campione per rimuovere i residui insolubili.

8 Campioni proteici Estratti di tessuti o cellule Proteine ricombinanti etichettate con antigeni (tags: HA, T7) Virus interi purificati Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma)

9 Proteasi Estrazione delle proteine Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) pH Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio)

10 Elettroforesi

11 Analisi elettroforetica delle proteine del siero

12 Elettroforesi La velocità di una molecola carica che si muove in un campo elettrico è direttamente proporzionale alla forza del campo elettrico (E) e alla carica della molecola (q) ed è inversamente proporzionale alle dimensioni della molecola e alla viscosità del mezzo in cui si muove (forze frizionali fo resistenza): v = Eq/f dove f=6πrη

13 Fattori che influenzano la velocità di migrazione CAMPIONE (Carica, Dimensioni, Forma) TAMPONE (Concentrazione, pH) SUPPORTO (Adsorbimento, Filtrazione molecolare)

14 SUPPORTI Non setaccianti (Carta), acetato di cellulosa Setaccianti Gel di poliacrilammide(PAG) Gel di Agarosio

15 Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

16 Elettroforesi di DNA I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide I campioni di DNA vengono caricati ed e applicata una differenza di potenziale Il DNA, carico negativamente, migra verso lelettrodo + I frammenti di DNA piu piccoli migrano piu velocemente

17 Elettroforesi di Proteine Piu complessa dellelettroforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e fatto di poliacrilammide

18 Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

19 Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dellelettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma NomeCaricaMassaForma Proteina Q Proteina R +330kD 4 42kD

20 Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni SDS Carica Massa +3 30kD 4 42kD Carica Massa kD kD

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22 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le proteine Aggiunge cariche negative alle proteine O S O O O - CH 2 CH 3 SDS

23 Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

24 Sistemi per la corsa di SDS-PAGE Amersham Biosciences Medio (16 x 16 cm)Piccolo (8 x 10 cm) Bio-Rad

25 SDS-PAGE Colorazione con Blu di Coomassie acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

26 Come funziona un Gel SDS-PAGE ? s-s SDS, calore Proteine con SDS + – Le proteine cariche negativamente si muovono verso lelettrodo positivo Proteine piu piccole si muovono piu velocemente Le proteine si separano per dimensione

27 Cosa ce nel buffer di caricamento? Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o -Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

28 Il Gel E costituito da due parti: Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8 Running gel: 8-14% gel separatore, pH 8.8 Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice Polimerizzazione piu rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS

29 Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8 SDS ddH2O TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS)

30 Il Gel Come funziona: Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) Si muovono verso il gel separatore (resolving) Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore + – Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8

31 Il Gel % di acrilammide consigliata 8% 10% 12% Dimensioni delle proteine kDa kDa kDa

32 Visualizzazione delle proteine nel gel I due metodi piu usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con largento Silver staining (puo essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie stainingSilver staining

33 Stima dei pesi molecolari Distanza (mm dal pozzetto) Dimensioni in kDa kD mm

34 Stima dei pesi molecolari

35 Western Blotting

36 Southern Blot: Per lanalisi del DNA. (sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per lanalisi dell RNA. (sonda = DNA o RNA). Western Blot: Per lanalisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

37 Cosa e un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

38 Qual e la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo A cosa serve il Western Blot? + – ?

39 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel. (Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o blocking. (La saturazione e usata per prevenire le interazioni non specifiche tra lanticorpo e la membrana)

40 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dellanticorpo primario. (Lanticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dellanticorpo secondario. (Lanticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente lanticorpo primario, gia legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o detection. (Lenzima coniugato allanticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

41 Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E necessaria limmobilizzazione per: Preservare in maniera permanente lesperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu comune e il trasferimento su membrana Nitrocellulosa PVDF (Polivinilidene fluoride) Nylon Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

42 membrana

43 Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso lelettrodo positivo Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso lelettrodo positivo e si legano alla membrana Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

44 Trasferimento dal catodo (-) all anodo (+) 1) Spugnette 2) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 3) Gel 4) Membrana 5) 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento 6) Spugnette Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

45 Apparato per il trasferimento Semi-dry

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47 Componenti del tampone di trasferimento: 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento

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49 Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dellanticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA) Western blot: terza fase saturazione o blocking

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51 Lanticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana Anticorpi come sonde: Molto sensibili Possono essere prodotti Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) Generando anticorpi monoclonali (mAb) Economici Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

52 Anticorpi Ab + Ag AbAg Kd Kd = = M [Ab] [AbAg]

53 Anticorpi Anticorpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza lantigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria.

54 Anticorpi policlonali Produzione Immunizzazione ripetuta dellanimale con lantigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e prelevato nel momento di picco di produzione dellanticorpo ed e purificato il siero Il pool degli anticorpi riconosce molti epitopi dellantigene usato per limmunizzazione

55 Anticorpi monoclonali Riconoscono solo un epitopo

56 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

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58 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

59 Anticorpi Anticorpo primario Riconosce la proteina Anticorpo secondario Lega lanticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dellenzima sara convertito in un prodotto colorato Puo anche essere radioattivo o fluorescente

60 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

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62 Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dallenzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondari biotinilati Western blot: sesta fase rivelazione o detection

63 HRP Western blot HRP substrato luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina

64 Quanta proteina di interesse ce? A cosa serve il Western Blot? Proteina di interesse Bande non specifiche [Proteina], pg


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