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Le reazioni sierologiche Microbiologia, immunologia e laboratorio Fabio Fanti: da pag. 37 a 46 Reportage fotografico tratto da google immagini.

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1 Le reazioni sierologiche Microbiologia, immunologia e laboratorio Fabio Fanti: da pag. 37 a 46 Reportage fotografico tratto da google immagini

2 Le reazioni sierologiche Sono le reazioni antigene-anticorpo che avvengono in vitro. Che cosa sono?

3 Si eseguono quando: Si vuole ricercare la presenza di anticorpi nel siero di un paziente per diagnosticare una malattia infettiva; Siero paziente (siero immune) + antigene corrispondente si vuole identificare un microrganismo in base agli antigeni che possiede. Sospensione microbica (antigeni) + antisiero (anticorpi) Quando si eseguono?

4 Le reazioni sierologiche possono essere di diversi tipi: Agglutinazione: quando lantigene è corpuscolato (globuli rossi, batteri); Precipitazione: quando lantigene è solubile; Neutralizzazione:quando lantigene, per azione del corrispondente anticorpo, perde la sua attività; Lisi: quando lantigene è corpuscolato e la reazione avviene in presenza di complemento. Quali possono essere le reazioni sierologiche?

5 Antigene + Anticorpo Immunocomplesso Alla base di ogni reazione sierologica cè la formazione dell immunocomplesso Che cosa si forma dallunione di un antigene con il suo anticorpo?

6 Come si spiega la formazione degli immunocomplessi? Teoria del reticolo: è la teoria che spiega il processo di formazione degli immunocomplessi. Il reticolo si forma solo quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale cioè si creano dei ponti tra un immunocomplesso e laltro (B). A B C

7 Agglutinazione diretta antigeni corpuscolati Agglutinazione diretta antigeni corpuscolati vengono posti a contatto con siero contenente anticorpi specifici antigeni presenti sulla superficie delle cellule batteriche Passiamo in rassegna i vari tipi di reazione sierologica

8 Agglutinazione indiretta Antigeni o Anticorpi vengono fatti aderire artificialmente alla superficie di particelle corpuscolate come il lattice di polistirolo. La reazione di agglutinazione è molto sensibile anche a piccole quantità di anticorpi ed è molto usata per esempio per la TIPIZZAZIONE SIEROLOGICA (tecnica di identificazione che fa uso di antisieri che reagiscono con i vari antigeni batterici permettendone il riconoscimento). Ricorda!

9 I GRUPPI SANGUIGNI Nel 1901 il medico viennese Karl Landsteiner scoprì che sulla superficie dei globuli rossi dell'uomo sono presenti delle sostanze chiamate agglutinogeni (antigeni) e che nel plasma ci sono degli anticorpi chiamati agglutinine. Sulla base di queste scoperte il dottor Karl Landsteiner distinse nella specie umana tre gruppi sanguigni che vennero chiamati A, B, 0 (zero). Nel 1902 venne scoperto il quarto gruppo chiamato AB. Agglutinazione La reazione di agglutinazione, viene usata anche in EMATOLOGIA.

10 I gruppi sanguigni rappresentano quindi diversi tipi di sangue, distinti in base alla presenza o meno, sul globulo rosso, di antigeni e di agglutinine plasmatiche. Le agglutinine sono anticorpi capaci di distruggere in vitro e in vivo i globuli rossi contenenti antigeni di gruppo diverso, tramite una reazione di agglutinazione.. ATTENZIONE! Il ricevente non deve avere anticorpi rivolti contro i globuli rossi del donatore poichè se ciò si verificasse, la vita stessa del ricevente, potrebbe essere in pericolo.

11 IL FATTORE RH Nel 1941 Landsteiner e Wiener misero in evidenza nei globuli rossi di una scimmia, Macacus Rhesus, e successivamente in quelli umani, un nuovo antigene che chiamarono fattore Rh capace di determinare la comparsa di agglutinine specifiche nel sangue di altri individui. Un 'immunizzazione nei confronti di antigeni Rh può manifestarsi soltanto quale risultato di una trasfusione o di una gravidanza.

12 Determinazione dei gruppi sanguigni Per eseguire il gruppo sanguigno basterà mettere a contatto una goccia di antisiero (contiene lanticorpo) con una goccia di sangue (antigene) ed osservare in quale vetrino si osserva lagglutinazione. (antigeni presenti sulla superficie dei globuli rossi)

13 Lagglutinazione in ematologia è ben visibile quando: sono coinvolti gli anticorpi IgM (legano molte emazie ); E ben visibile anche quando si superano le cariche elettriche di superficie che tendono a far respingere le emazie, ciò è possibile utilizzando: soluzioni saline; enzimi; proteine come albumina; siero antiglobuline umane come il SIERO DI COOMBS. Come si può fare per rendere visibile lagglutinazione in EMATOLOGIA?

14 Test di Coombs Per ricercare gli anticorpi anti – Rh si deve eseguire il Test di Coombs. Può essere diretto: ricerca degli anticorpi sul sangue del neonato. Oppure indiretto: ricerca degli anticorpi nel siero della madre. MEN Malattia Emolitica del Neonato

15 Test di Coombs Diretto Ricerca sul sangue del neonato Anticorpi adesi alla superficie dei globuli rossi + Siero di Coombs (siero antiglobuline umane) Agglutinazione +=

16 Test di Coombs Indiretto Ricerca degli anticorpi anti-Rh nel siero della madre Siero materno + Emazie Rh + Formazione di immunocomplessi + Siero di Coombs = Agglutinazione

17 antigene solubile precipitatoPrecipitazione antigene solubile (macromolecole o tossine) viene messo a contatto con un siero contenente anticorpi specifici. La formazione degli immunocomplessi si può osservare con un precipitato. Anche in questo caso il reticolo si forma solo quando la concentrazione degli antigeni e degli anticorpi è ottimale cioè si creano dei ponti tra un immunocomplesso e laltro. Questa fase corrisponde al punto di equivalenza dove è massima la quantità di precipitato. Per spiegarla si può fare questa prova Quale caratteristica ha lantigene, in una reazione di precipitazione?

18 Esempi di reazione di precipitazione Immunodiffusione Immunoelettroforesi Si esegue prima una elettroforesi delle proteine del siero su gel di agar stratificato su lastra di vetro. Ai lati, su dei solchi viene introdotto lantisiero che contiene anticorpi contro le proteine del siero. Allunione tra proteine del siero separate e i rispettivi anticorpi, si formano degli archi caratteristici. Si tratta di pozzetti scavati nellagar. Quando si introducono antigene o anticorpo, essi diffondono e danno origine ad una banda di precipitazione nel punto dincontro.

19 Western blot (immunofissazione) Usata per identificare gli anticorpi contro il virus dellAIDS Altro modo per evidenziare la reazione antigene -anticorpo

20 FISSAZIONE DEL COMPLEMENTO E una tecnica utilizzata per la diagnosi di sifilide Siero in esame con anticorpi + antigene immunocomplesso COMPLEMENTO di cavia SISTEMA RIVELATORE formato da: Emolisine + Emazie Se il complemento è stato utilizzato dal 1^ immunocomplesso, non ci può essere emolisi, la reazione è positiva (presenza di anticorpi). Se invece si verifica emolisi, significa che il complemento si è reso disponibile per il sistema rivelatore, la reazione è negativa. + Altro tipo di reazione antigene - anticorpo Immunocomplesso +

21 Immunoenzimatica E.L.I.S.A. Enzyme Linked Immunosorbent Assay I pozzetti possono contenere lantigene oppure lanticorpo come nel filmato.Facciamo lesempio che il pozzetto contenga lantigene. Si aggiunge il siero campione che contiene lanticorpo. Si incuba e si procede al lavaggio per eliminare gli anticorpi che non si sono legati. A questo punto si aggiungono anticorpi anti-Ig marcati con un enzima. Questi si fissano agli anticorpi. Si procede al lavaggio e si aggiunge poi uno specifico substrato per lenzima. Se compare una colorazione significa che la reazione è positiva. Lintensità del colore viene misurata allo spettrofotometro.

22 IMMUNOFLUORESCENZA Gli Ab sono marcati con molecole fluorescenti (fluorescina), sono molecole in grado di assorbire la luce ultravioletta emettendo poi radiazioni nel campo del visibile. Per poter osservare la reazione si utilizza un microscopio a fluorescenza. Diretta Siero Altri modi per evidenziare la reazione antigene -anticorpo Diretta Indiretta

23 Radioimmunologia R.I.A. Radio Immuno Assay Sono tecniche in cui la reazione antigene anticorpo è evidenziata da un isotopo radioattivo. La radioattività prodotta viene misurata con appositi strumenti. Questa tecnica si utilizza nella determinazione della concentrazione degli ormoni. L' isotopo è ciascuno degli atomi di uno stesso elemento, con lo stesso numero atomico ma con differente numero di massa. Possiedono lo stesso numero di protoni ed elettroni (quindi proprietà chimiche uguali) ma un diverso numero di neutroni (quindi proprietà fisiche diverse).


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