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CRIOCONSERVAZIONE DI SPERMATOZOI, OVOCITI ED EMBRIONI.

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Presentazione sul tema: "CRIOCONSERVAZIONE DI SPERMATOZOI, OVOCITI ED EMBRIONI."— Transcript della presentazione:

1 CRIOCONSERVAZIONE DI SPERMATOZOI, OVOCITI ED EMBRIONI

2 Concetti di criobiologia I fattori importanti sono: Il controllo preciso della quota di raffreddamento e riscaldamento che determina il destino finale dellacqua che è presente dentro la cellula, durante il processo di crioconservazione. I crioprotettori hanno il ruolo di proteggere la cellula durante il congelamento e di ridurre i danni causati dagli effetti di soluzione a quote lente di raffreddamento. Il seeding (induzione del primo nucleo di ghiaccio nella soluzione in cui vogliamo congelare le nostre cellule) serve a evitare il super raffreddamento ed a prevenire la formazione significativa di ghiaccio intracellulare. Inoltre è fondamentale la realizzazione di un equilibrio osmotico e termico durante il congelamento.

3 Il raffreddamento (riduzione della temperatura) provoca : –riduzione delle attività enzimatiche –riduzione dei meccanismi di trasporto attivo –modificazioni della conformazione della membrana cellulare Con la riduzione della temperatura si ha un progressivo aumento della solubilità dei gas con aumento delle pressioni parziali di CO2, O2, N2. Continuando il raffreddamento si assiste alla comparsa di cristalli di ghiaccio. Comparsa del tutto casuale. Il primo nucleo di ghiaccio così può comparire sia allesterno della cellula che al suo interno danneggiandola. Le cellule possono essere danneggiate anche dai cambiamenti improvvisi di temperatura che si producono al di sotto del punto di congelamento. Questo tipo di danno è chiamato cold-shock.

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5 Se la cellula viene raffreddata molto lentamente, il trasporto massivo di acqua allesterno di essa riduce la differenza di potenziale chimico a livello della membrana, risultando in una progressiva disidratazione. Se la cellula viene raffreddata molto rapidamente, potrebbe esserci poco tempo per il trasporto di acqua. Di conseguenza il citoplasma super-raffredderà ed eventualmente congelerà allinterno della cellula.

6 CURVA DI RAFFREDDAMENTO La curva di raffreddamento è specifica ed ottimale per ogni tipo di cellula. I fattori che devono essere tenuti presenti sono: Contenuto intracellulare di acqua Permeabilità della membrana Rapporto superficie/volume della cellula Ovociti e preembrioni hanno un basso rapporto superficie/ volume e una quantità relativamente alta di acqua intracellulare, necessitano perciò di un raffreddamento lento (da 0.1 a 1°C/min).

7 CRIOPROTETTORI I crioprotettori sono sostanze a diversa composizione chimica che hanno in comune unelevata solubilità in acqua associata ad una tossicità dipendente dalla concentrazione di utilizzo. La loro azione protettiva si esplica in vari modi: con unazione diretta sulla membrana cellulare modificano lambiente intra ed extra cell. sostituendosi allacqua e diminuendo la formazione di cristalli di ghiaccio abbassano il punto di congelamento della soluzione e permettono una maggiore disidratazione delle cell. durante il cong. lento. Linterazione tra crioprotettore e cellula è mediata da: tempo di esposizione allagente chimico Temperatura a cui avviene lesposizione Stadio di divisione dellembrione

8 SOSTANZE PIU UTILIZZATE Si dividono in due categorie : Crioprotettori in grado di penetrare attraverso le membrane cellulari Crioprotettori non in grado di penetrare attraverso le membrane cellulari

9 Crioprotettori Criop. penetranti (pm< 400) DMSO (dimetilsolfossido) glicerolo PROH (1,2 propanediolo) glicole etilenico Criop. non penetranti (pm> 1000) zuccheri : saccarosio,fruttosio, glucosio, destrosio amido lipoproteine PVP (polivinilpirrolidone)

10 SCONGELAMENTO Lo scongelamento rappresenta lultima fase critica dellintero processo di crioconservazione e può essere lento o rapido. Le condizioni ottimali per lo scongelamento sono strettamente legate alla modalità di congelamento. In generale se il raffreddamento lento viene interrotto a temperature relativamente elevata ( -30°C, -40°C), nelle cellule rimane una certa quantità di acqua, per cui il riscaldamento deve essere rapido per evitare la cristallizzazione dellacqua in cristalli di dimensioni maggiori che danneggerebbero le cellule. Se invece il congelamento lento continua fino a - 80°C, le cellule sono molto più disidratate e lo scongelamento deve avvenire molto più lentamente per permettere unadeguata reidratazione.

11 A temperatura ambiente è opportuno diluire il crioprotettore in una serie di tappe a concentrazioni decrescenti : in questo modo la cellula si rigonfia ad ogni tappa di diluizione, ma non tanto da scoppiare.

12 Sopravvivenza cellulare in rapporto alla velocità di congelamento

13 VANTAGGI DI UN PROGRAMMA DI CONGELAMENTO OVOCITI Ovociti sovrannumerari ( rischio di gravidanze multiple) Alternativa al congelamento di embrioni Si crea una possibilità di gravidanza in pazienti con neoplasie che diventerebbero sterili in seguito a chemioterapia Creazione di banche degli ovociti per pazienti che soffrono di patologie a carico del sistema riproduttivo Programmi di ovo-donazione

14 CARATTERISTICHE DELLOVOCITA UMANO QUALITA E MATURITA La selezione degli ovociti adatti al congelamento, per qualità e maturità, è difficile dal momento che gli ovociti migliori vengono subito utilizzati per la fertilizzazione in vitro. DIMENSIONI E la caratteristica più importante. Nei mammiferi al momento dellovulazione è la cell. più grande (diametro che varia dai nel topo, a 130 nei bovini e nelluomo). Più sono grandi le dimensioni più è bassa la probabilità di sopravvivenza perché il tempo di equilibrio è tanto più lungo quanto è maggiore la massa citoplasmatica. CUMULO OOFORO Nel congelamento si tende a ridurre meccanicamente o chimicamente il cumulo ooforo per incrementare le possibilità di sopravvivenza dopo cong /scong. TEMPO DI ESPOSIZIONE AL CRIOPROTETTORE E necessaria una più lunga esposizione al crioprotettore relativamente alle dimensioni dellovocita. Per contro deve esserci un rapido scambio di soluti per ridurre il tempo di esposizione.

15 POSSIBILI DANNI DA CONGELAMENTO Apparato mitotico Si ritiene che il fuso sia sensibile alle variazioni di temperatura e che il raffreddamento possa essere responsabile di interferenze nella separazione dei cromatidi al momento della fecondazione. Granuli corticali Gli ovociti sopravvissuti allo scong. mostrano unalta percentuale di poliploidia dopo fertilizzazione in vitro. Un esame al microscopio elettronico ha dimostrato che il numero dei granuli corticali sembra ridursi ed alcuni mostrano segni di lisi.

16 MATERIALI E METODI Viene utilizzato un congelatore computerizzato (Planer Krio 10 Serie II) collegato ad una pompa per richiamo di azoto liquido. Nel computer vengono inserite le curve di discesa della temperatura che si vogliono utilizzare.

17 Le soluzioni per il congelamento sono: OVOCITIEMBRIONI SACCAROSIO0.2 M0.1 M PROH1.5 M1.5 M Il programma di congelamento è: START T°C=20°C I STEP =- 2°C/min fino a – 8°C II STEP=hold per seeding di 10 min. III STEP=-0.3°C/min fino a –30°C IV STEP= -50°C/min fino a –150°C V STEP =hold per 2 ore VI STEP=direttamente in azoto liquido

18 CONGELAMENTO DI PRE-EMBRIONI CONGELAMENTO LENTO I protocolli più usati sono quelli che prevedono lutilizzo di congelatori computerizzati. I crioprotettori più usati sono PROH per emb 2-4 cell, DMSO per emb 4-8 cell e GLICEROLO per le blastocisti. Le percentuali di successo, in termini di gravidanze ottenute, variano da 11% a 23%. CONGELAMENTO ULTRA RAPIDO Il crioprotettore è il DMSO. Il congelamento viene effettuato immergendo direttamente gli embrioni in azoto. Le percentuali di successo sono basse.

19 CRIOCONSERVAZIONE DEL SEME APPLICAZIONI CLINICHE La crioconservazione del seme nelle banche può essere suddivisa nelle 2 vaste aree della AUTOCONSERVAZIONE (cioè conservazione del seme per proprio uso futuro) e CONSERVAZIONE DEL SEME DEL DONATORE. Motivi per lautoconservazione: Preservazione del proprio potenziale riproduttivo prima di chemioterapia, terapie radianti o chirurgiche per il cancro, che potrebbero rendere sterile o ipofertile Assicurazione della fertilità ad un uomo che si sottoponga a vasectomia Conservazione per convenienza: assicurare che gli spm. di un uomo siano presenti per la sua partner anche in assenza o come riserva per quei pazienti che non sono in grado di produrre al momento opportuno seme fresco (IUI-GIFT-IVF)

20 CRIOPROTETTORI per congelamento del seme Il glicerolo è di gran lunga il migliore e il più utilizzato alla concentrazione finale del 75%. Il tuorlo duovo di gallina che viene spesso incluso nel medium usato per congelare spermatozoi umani non è di per sé un crioprotettore, ma sembra conferire maggiore fluidità alla menbrane citoplasmatiche degli spm.

21 STOCCAGGIO del seme Le pagliette sono, probabilmente, il sistema più usato. Il loro volume singolarmente è di 0,25 ml e 0,5 ml. Dopo essere state riempite vengono sigillate (con tappi di plastilina o a caldo).

22 CRIOCONSERVAZIONE Raffreddamento a vapori di azoto Si sfrutta il fatto che sopra una determinata quantità di azoto si stabilisce un naturale gradiente di temperatura, dovuto allevaporazione dellazoto liquido. Le pailletes vengono posizionate orizzontali ad altezze determinate, sopra la fase liquida dellazoto, per periodi determinati (10).

23 RISULTATI Ladeguatezza della crioconsevazione del liquido seminale viene solitamente valutata usando la percentuale di ritorno alla motilità o fattore di criospermia (CSF) % sperm. mobili dopo scongelamento % sperm. mobili prima dello scongelamento Un buon CSF è >= al 50%. CSF= x 100


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