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LA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICO NELLANEMIA DI FANCONI CARLO DUFOUR XXIII CONGRESSO AIEOP ABANO, 22-24 ottobre 2006.

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1 LA FISIOPATOLOGIA DEL DIFETTO EMOPOIETICO NELLANEMIA DI FANCONI CARLO DUFOUR XXIII CONGRESSO AIEOP ABANO, ottobre 2006

2 AUTOSOMICA-RECESSIVA e X-LINKED Grande eterogeneità clinico-biologica Ca 1200 casi descritti in letteratura. M/F ratio = 1.3/1 Frequenza Eterozigote 1:300 (USA - Europa) 1:100 (Sud Africa) ANEMIA DI FANCONI Prevalenza 1- 5 / milione 13 Geni Identificati ( A, B, C, D1, D2/BRCA1,E,F,G,J,L, M, PALB2,)

3 Aumentata fragilità cromosomica spontanea e indotta da alchilanti bifunzionali (DEB, MMC). FENOTIPO CLINICO Insufficienza Midollare Progressiva Anomalie Somatiche Suscettibilità ai Tumori

4 ANOMALIE SOMATICHE 1207 PAZIENTI Cute 60% Bassa Statura 57% Anomalie arti superiori 48% Ipogonadismo 37% Ipogonadismo 3% Testa 27% Occhio 26% Reni 23% Ritardo di sviluppo 13% Peso nascita % Orecchio 10% Anomalie arti inferiori 8% Ipereflessia 7% Altre anomalie scheletro 6% Anomalie cardio-polmonari 6% Anomalie gastro-intestinali 4% Altre 5% Anomalie assenti o non riferite 25% Solo bassa statura 1% Solo cute 3% Cute + bassa statura 4% Bassa statura e/o cute 8% Normali/ quasi normali 25-41%

5 SUSCETTIBILITA ai TUMORI Incidenza globale > 15%. (leucemia, K cell squamose testa, collo, esofago, MDS, encefalo, Wilms, ginecolocici). 25% of casi SENZA aplasia precedente. Il tumore può essere la sola manifestazione della AF Femmine più colpite dei maschi per tumori solidi (anche se NON si considerano i tumori ginecologici). Gene FANCB ?

6 SUSCETTIBILITA ai TUMORI Problema emergente dato lattuale miglioramento dei risultati del TMO sullaplasia. Pazienti FANCD1/BRCA2 hanno altissima incidenza di cancro. Più di un tumore/paziente sotto i 5 anni di vita

7 INSUFFICIENZA MIDOLLARE PROGRESSIVA Trombocitopenia Anemia Neutropenia APLASIA 5 anni 10 anni AUMENTO MCV HbF e A g i eritrocitario Possono anticipare la citopenia Clone citogenetico in circa 30% dei pazienti Anomalie radio rischio 5.5 volte maggiore di insuff midollare Rischio anche per malformazioni cuore, rene testa, udito Principale causa di morbilità e mortalità

8 EVOLUZIONE A MDS/LA Più spesso associata a monosomia cr 7 e iso cromosoma 1q Non è automatica levoluzione di MDS a LA Le anomalie citogentiche possono fluttuare Gain di 3q indica maggior rischio che MDS morfologica progredisca a LMA (Tonnies, Blood 2003) La morfologia rimane un importante marcatore di evoluzione verso MDS/AL

9 ANEMIA DI FANCONI. PERCHE Il pathway FA è inattivato (FANCF) in varie neoplasie ( ovaio, polmone, testicolo, utero ) e in LMA (FANCA). Se il pathway FA è integro (non è FA) linee cellulari di K ovarico acquisiscono resistenza al Cisplatino. Taniguchi et al Nat med, 2003;9: Modello per evoluzione leucemica 3. Modello per insufficienza midollare 1. Malattia precancerosa

10 EVOLUZIONE A MDS/LEUCEMIA 1.TNF- e infiammazione hanno azione pro-leucemogenica. 2. Questa azione avviene tramite la produzione di ossidanti che causano instabiità genomica. 3. Anti infiammatori, anti-TNF- ed anti ossidanti possono avere un ruolo anti leucemogenico.

11 INSUFFICIENZA MIDOLLARE La cellula staminale ematopoietica presenta una esagerata risposta apoptotica a stimoli esogeni Rio. P & Bueren J. Blood 2002 Sep 15;100(6): Aube M & Careau M; Stem Cells; 2002;20 (5): Habi O, & Carreau M, Stem Cells 2005, Jul 14; ahead of print) Quali stimoli esogeni? Dove è il problema? Come agiscono?

12 STIMOLI ESOGENI 1 Citochine Mielosoppressive 1. TNF- è aumentato nel siero dei patienti FA Shultz JC, Am J Hematol, 1993;42: Rosselli F, 1994; 83: IFN- and TNF- sono over-expressi nelle MNCs midollari stimolate dei pazienti FAFA Dufour C et al, Blood 2003;102:

13 MIP-1, FASL INTRACYTOPLASMIC EXPRESSION OF TNF-, IFN-, MIP-1, FASL IN MARROW MNCs OF FA PATIENTS TNF - + CD3+% TNF (8.68) (0.00) CD3+ MRFI TNF (3.09) (0.00) CD3- % TNF (6.57) (0.53) CD3- MRFI TNF (0.90) (0.18) IFN - CD3+% - IFN 8.57(7.91) (0.71) CD3+MRFI - IFN 2.29(1.25) (0.35) CD3-% - IFN 5.57(7.07) (0.7) CD3-MRFI - IFN 2.00(2.65) (0.00) CD3+% FASL 0.00(0.00) (0.00) CD3-%FASL 0.00(0.00) (0.00) CD3+ MIPA (0.00) (0.00) CD3-%MIPA (0.00) (0.00) Mean (SD) Median Min-Max Mean (SD) Median Min- Mix P FA Patients Controls Dufour C et al, Blood 2003

14 STIMOLI ESOGENI 2 Citochine Mielosopressive 4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche primarie in vitroro Dufour C et al, Blood 2003;102: IFN-, TNF-, MIP 1-, FAS L nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi. Rathbun RK, Blood 1997,90: , Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91: , Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179:79-86

15 BLOCCO DI TNF- IN VITRO. EFFETTO SULLA CRESCITA ERITROIDE di PAZIENTI FA PatientsControls BFU-e B Patients Controls CFU-e A P Dufour et al, Blood 03

16 STIMOLI ESOGENI 3 Citochine Mielosopressive 4. TNF- è dannoso per le cellule eritropoietiche in vitro Dufour C et al, Blood 2003;102: IFN-, TNF-, MIP 1- nei topi FANCC fanno morire i progenitori ematopoietici per eccesso di apoptosi. Rathbun RK, Blood 1997,90: , Whitney MA, Blood 1996;88:49-58, Haneline L, Blood,1998;91: , Otsuki T, J Cell Physiol, 1999;179: TRAIL induce apoptosi in line cellulari linfobastoidi FANCACA

17 APOPTOSI (Tunel) FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA medium + Trail Microscopic images of TUNEL positive nuclei: apoptotic cells with fragmented DNA are stained bright green, non-apoptotic cells are stained blue with DAPI (magnification 20X). Apoptosis was evaluated at single cell level by TUNEL in situ technique. The TUNEL reaction preferentially labels DNA strand breaks generated during apoptosis. This allows discrimination of apoptosis from necrosis.

18 APOPTOSI indotta da TRAIL FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA p h16h FANCA CORRETTA HSC072 HSC072FAA Cell lines were cultured in the presence or absence of 100 ng/ml Superkiller TRAIL and apoptosis was measured at 4, 16hours in culture by staining cells with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated annexin V. Flow cytometric results are expressed as median, maximum and minimum levels of percent increment Annexin V+ cells from seven experiments. % increment AnnexinV + cells * p * +

19 STIMOLI ESOGENI 4 Agenti Ossidanti 6. Lalternanza di IPOSSIA-RIOSSIGENAZIONE dà morte prematura nelle cellule ematopoietiche midollari FANCC (-/-) segnalando via p53 e up-regulando p 21 (Zhang X, Blood Jul 1;106 (1):75-85) 2005). 7.H 2 O 2 induce morte nelle cellule FANCC-/- (Bagby and Alter, Semin Hematol,2006, 4, ).

20 COME AGISCE TNF- COME AGISCE TNF- 1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosi via ROSROS

21 Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005 Lantiossidante Se Met corregge lapoptosi nei progenitori ematopoietici dei topi FANCA (-/-) esposti a TNF-.

22 COME AGISCE TNF- COME AGISCE TNF- 1. Nei progenitori ematopoietici dei topi FANCC e FANCA, TNF- induce apoptosis via ROS 2. Questo effetto è ASK1 e p38 dipendentedipendente

23 Dopo esposizione a TNF- i progenitori ematopoietici di topi FANCC(-/-); ASK1(-/-) crescono a livello WT ASK-1 (Apoptosis Signal Regulating Kinase 1) Euna kinasi ad azione pro-apoptotica. NO ASK = NO APOPTOSI FANCC(-/-); ASK1(-/-) WT

24 p38 è una protein kinasi downstreamed rispetto ad ASK-1 nella cascata apoptotica attivata dai ROS. Vishehsaraei KM et al Blood on line Aug 18, 2005 Inibizione di p38 corregge lapoptosi dei progenitori ematopoietici FANCA(-/-) a livello WT. FANCA WTWT

25 COME AGISCONO TNF- e IFN - COME AGISCONO TNF- e IFN - 4.L effetto negativo di TNF- e IFN- sui progenitori ematopoietici del topo FANCC è mediato da NO NO

26 Hadjur S., Blood 2003 May 15;101 (10): Lesposizione a dosi crescenti di IFN- riduce il numero medio di colonie maggiormente in FANCC(-/-) che in WT Il Blocco della produzione di NO riporta la crescta dei progenitori FANCC (-/-) a livello di WT dopo esposizione a IFN- FANCC WT FANCC WT

27 Le citochine mielosoppressive (TNF-,IFN- ) e gli agenti ossidanti (H 2 O 2 ) agiscono attraverso differenti mediatori intracellulari (ROS, NO, ASK-1, p38,STATs, PKR/Hsp70). Tutti comunque conducono la cellula ematopoietica allapoptosi. SOMMARIO

28 SOMMARIO INSUFFICIENZAMIDOLLARE TNF- IFN- H 2 O 2 APOPTOSI ASK 1 P38 NO PKR Hsp70 STATs CELLULA EMOPOIETICA FANCONI

29 IMPLICAZIONI CLINICHE STUDIO PILOTA MULTICENTRICO CON ANTI-TNF-α IN PAZIENTI CON: FANCONI ANEMIA 1. FANCONI ANEMIA con INSUFFICIENZA MIDOLLARE SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO 2. ANEMIA APLASTICA ACQUISITA RESISTENTE ALLIMMUNOSOPPRSSIONE E SENZA DONATORE COMPATIBILE DI MIDOLLO OSSEO Coordinatore Carlo Dufour Unità di Ematologia. ISTITUTO G.GASLINI, Largo G.Gaslini Genova. tel Fax ; e- mail: gaslini.ge.it gaslini.ge.it Approvazione Comitato di Etica, Ist. Gaslini. 2 dic 2004 TNF- importante nellapoptosi delle cellule emopoietiche FA


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