Chimica Fisica Biologica La caratterizzazione chimico-fisica di proteine mediante spettroscopia di dicroismo circolare (CD) Studio degli equilibri conformazionali.

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1 Chimica Fisica Biologica La caratterizzazione chimico-fisica di proteine mediante spettroscopia di dicroismo circolare (CD) Studio degli equilibri conformazionali (in relazione all’attività biologica) della chaperonina 10 dal micobatterio della tubercolosi. Gaetano M.M. Izzo

2 Le proteine, per svolgere la propria funzione, devono avere una
Intoduzione: Le chaperonine Le proteine, per svolgere la propria funzione, devono avere una CONFORMAZIONE CORRETTA MA… Nell’ambiente cellulare esistono condizioni che ostacolano il ripiegamento o che causano la perdita della struttura proteica

3 Fattori che possono “disturbare” il processo di ripiegamento di una
proteina nascente Esposizione di regioni idrofobiche o che si ripiegano lentamente Sintesi NON contemporanea di tutti i domini della proteina Presenza di grandi quantità di macromolecole

4 Instabilità delle proteine nell’ambiente cellulare
Denaturazioni e modificazioni (ossidazioni, glicosilazioni…) spontanee Presenza di mutazioni che causano l’assunzione di conformazioni anomale Esposizione ad agenti tossici ambientali: radicali dell’O2, metalli pesanti, alcuni antibiotici…

5 Le cellule possiedono meccanismi per prevenire l’aggregazione proteica e per ripristinare le giuste conformazioni  le proteine "chaperone"

6 Funzioni principali delle proteine “chaperone”
Impedire l’aggregazione e la precipitazione delle catene proteiche con una conformazione alterata o durante il processo di trasduzione Aiutare le catene polipeptidiche ad assumere una conformazione corretta durante la sintesi proteica o a riacquistarla dopo un evento che ne ha alterato la struttura Ruolo nella degradazione delle proteine alterate strutturalmente

7 Classi di proteine "chaperone"
Hsp 90 (Heat shock Protein, 90kDa) Hsp 70 (70 kDa) Hsp 60/Chaperonine (60 kDa) Hsp 40/Dna J (40 kDa) sHsp (small Heat shock Protein, 12-43kDa)

8 Chaperonine o Hsp 60 Eucarioti Procarioti Compartimento cellulare
Struttura Gruppo I: Hsp60 Gro-EL Mitocondri Due anelli eptamerici; oligomeri Gruppo II: TRiC/ CCT TF55, TF56, Termosoma Citosol, nucleo Anelli octamerici o nonamerici; eteromeri

9 Le chaperonine Facilitano il ripiegamento delle proteine nascenti e si legano ai substrati che non hanno una conformazione corretta per evitarne l’aggregazione e la precipitazione Struttura a doppio anello. Ogni anello è costituito da più subunità Suddivise in due gruppi in base alla presenza (gruppo I) o all’assenza (gruppo II) di una co-chaperonina

10 Chaperonine di gruppo I:struttura
Richiedono la presenza di una co-chaperonina Subunità Cavità centrale Dominio apicale Dominio intermedio equatoriale Residui idrofobici Sito per il legame e l’idrolisi dell’ATP

11 Chaperonine di gruppo I: meccanismo d’azione
Legame ai substrati aspecifico ATP Co-chaperonina Proteina non ripiegata correttamente Proteina che si ripiega in un ambiente protetto

12 Chaperonine di gruppo II:struttura
Non necessitano di co-chaperonine 40% di omologia con le chaperonine di gruppo I Struttura costituita da due anelli octamerici o nonamerici, che delimitano una cavità centrale più grande di quella delle chaperonine di gruppo I Subunità simili a quelle delle chaperonine di gruppo I, ma con in più una protrusione elicoidale, che svolge la funzione delle co-chaperonine

13 Mycobacterium tuberculosis Chaperonin 10 (Mt cpn10)
Le chaperonine nei diversi organismi Le chaperonine cpn60 e cpn10 sono membri della famiglia delle heat shock proteins. Sono altamente conservate (40-50% identità) e sono coinvolte nel folding di polipeptidi sintetizzati di fresco. Per questa loro attività le cpn10 formano eptameri non covalenti. Mt cpn 10 come hcpn 10 sono in grado di attraversare le membrane (secrezione all’esterno della cellula) a differenza della cpn10 da E. Coli .

14 Superposition of C backbones of cpn10Mt heptamer (subunits A to G in red) and GroES(blue)
structures with residues 18 to 34 (cpn10Mt) and 16 to 32 (GroES) deleted. C atoms outside the rms fit of 1.3 Å2 are in green. Stereo views are from the side (A) and top (B).

15 The cpn10Mt tetradecamer
The cpn10Mt tetradecamer. (A) The tetradecamer viewed along the twofold NCS axis. (B) Sketch of the staggered arrangement of subunits viewed down the sevenfold NCS axis. (C) Electrostatic potential from +2.5 kT/e (blue) to -7.5 kT/e (red) of the molecular surface of subunits D, M, G, and J. The internal diameter at the rim of the heptamer base (21 Å) is marked by Tyr 73 side chains and at the midsection (30 Å) by Glu 35 side chains. Viewed along the twofold NCS axis.

16 Altre attività della Mt cpn10 (1)
A differenza di altri membri della famiglia che sono scarsamente immunogenici, la proteina cpn10 da Mt è uno degli antigeni immunodominanti del batterio. Individui sani ma positivi alla tubercolina hanno elevate dosi di anticorpi anti Mt cpn10 e linee cellulari T ottenute da questi individui reagiscono selettivamente ed in maniera pronunciata alla proteina cpn10. Questo ha indotto vari ricercatori ad identificare nella proteina un antigene protettivo nei confronti dell’infezione da Mt. A differenza di altri membri, la cpn10 da Mt è attivamente secreta dal batterio sia durante la replicazione in vitro sia all’interno di macrofagi infettati con Mt. Considerando che la secrezione comporta uno spostamento dal citosol della cellula, alla membrana e poi attraverso di essa, durante il cui tragitto la proteina si trova in ambienti di differente natura, è legittimo pensare che ciò sia accompagnato da cambi struttural/conformazionali e che vi sia un processo di dissociazione man mano che ci si avvicina alla membrana.

17 Altre attività della Mt cpn10 (2)
Forme ricombinanti della proteina hanno effetti farmacologici. Ad es. immunizzazione con la proteina protegge ratti dallo sviluppo di artrite da adiuvante, una forma sperimentale di artrite indotta con preparazioni microbiali, oppure da forme sperimentali di encefalomielite. Inoltre, l’immunizzazione con la proteina protegge cavie dallo sviluppo di aftaepizootica (malattia virale di ovini, bovini, suini). In vitro, sia il lisato di Mt che la proteina inducono riassorbimento osseo (degradazione ossea). Questa reazione è bloccata dall’uso di anticorpi anti-proteina, ciò indica che Mt ed in particolare la cpn10 sono le probabili cause della cosidetta tubercolosi ossea che riguarda 1-2% dei pazienti tubercolotici. In vitro la proteina induce apoptosi e/o proliferazione delle cellule linfocitarie facendo pensare che questo è un meccanismo attraverso cui si esplica la sua attività in vivo. Le ultime due attività si ottengono a dosi molto basse di proteina (circa nM).

18 Necessità di caratterizzare il monomero!!!
Tutte queste attività sono difficilmente riconducibili ad una specie strutturale unica come l’eptamero. In particolare, poiché a basse concentrazioni la proteina si dissocia è probabile che le ultime due attività siano dovute al monomero. Necessità di caratterizzare il monomero!!!

19 Caratterizzazione del monomero
Principali obiettivi: Confermare la secrezione di Mt cpn10 dal Mt, ma non per la GroES (cpn10 da E.Coli). Studiare le preferenze strutturali di Mt cpn10 in condizioni simili a quelle in cui la proteina si trova quando si avvicina all’interfaccia ambiente acquoso/strato lipidico o quando attraversa il doppio strato lipidico idrofobico della membrana cellulare. Comprendere se ci sono relazioni tra queste strutture e la secrezione di Mt cpn10.

20 Studi CD in presenza di solventi organici
Al fine di studiare l’attraversamento della membrana cellulare da parte del monomero, sono state effettuate misure CD di soluzioni acquose diluite di proteina, in tampone fosfato 50mM, aggiungendo altri solventi alla soluzione, quali MeOH, TFE (e AcCN), ed aumentandone via via la concentrazione. In questo modo si diminuisce la polarità e quindi la costante dielettrica del solvente e si mima l’effetto del cambio di polarità del mezzo in cui si trova la proteina sulla sua struttura, cosi’ come avviene nella cellula quando la cpn10 prima si avvicina alla membrana e poi ne attraversa il doppio strato lipidico. Si evidenziano quindi mediante CD, i cambiamenti della struttura del monomero che avvengono a livello di struttura secondaria. Mt cpn 10 e’ costituita da 99 residui aa con un PM di Da.

21 Spettri CD di Mt cpn10 in presenza di concentrazioni crescenti di MeOH (A) e di TFE (B).
In assenza di solvente organico, lo spettro CD nel lontano UV è caratterizzato da una intensa ellitticità negativa a nm che corrisponde alla struttura random coil e da una ampia spalla nella regione della struttura secondaria tra 215 e 235nm. All’aumentare della % di MeOH, si ha una progressiva diminuzione di intensità negativa a 199nm, ed essa si sposta a l più alte, e si ha un incremento di intensità del segnale nella regione di struttura secondaria. Al 70% di MeOH, lo spettro mostra un tipico profilo ad a-elica, con ellitticità a 206 e 222nm e non si modifica più con aggiunta di ulteriore MeOH. Dalla deconvoluzione di questo spettro si evidenzia che circa il 25% dei residui aa sono in a-elica ed il 22 in b-sheet. Questi risultati indicano che il monomero forma conformazioni contenenti eliche in condizioni di ridotta polarità del solvente. I solventi organici sono stati aggiunti ad una soluzione di proteina in KH2PO4, pH7.4. La conc. di KH2PO4 è 50mM e la conc. di proteina è tenuta a 4mM. Fig 1

22 Poichè in uno studio precedente si era visto che Mt cpn10 ad una conc
Poichè in uno studio precedente si era visto che Mt cpn10 ad una conc. 9.3mM in 65%MeOH, mostrava uno spettro CD tipico di un b-sheet, con un unico minimo di 218nm e ciò sembra in contrasto con la conformazione parzialmente ad elica vista nel nostro caso in condizioni simili, per comprendere quali sono le ragioni di questa differenza, è necessario fare spettri CD in una soluzione acqua/MeOH, mantendone costante il rapporto, e variando la concentrazione di proteina. Si vede così come la struttura di Mtcpn10 passa da una struttura parzialmente ad elica ad una struttura prevalentemente b all’aumentare della concentrazione di proteina. La transizione è netta ed avviene tra 9 e 18 uM. Da dati di spettrometria di massa per la soluzione 4mM di proteina si ha il segnale del monomero con massa uma, mentre si ha una specie con massa 21345uma corrispondente ad un dimero si ha per concentrazione 40mM. Si ha la copresenza delle due specie alle concentrazioni intermedie: la concentrazione di dimero aumenta all’aumentare della concentrazione di proteina. Tutto ciò indica che la transizione da alfa a beta è accompagnata da oligomerizzazione a dimero. Fig 3A + B A B Dipendenza dalla concentrazione della struttura CD di Mt cpn10 in soluzioni acqua/MeOH (1:1 vol/vol). (A) Spettri CD di Mt cpn10a tre diverse concentrazioni (B) Dipendenza dalla concentrazione dell’elliticità molare a 204nm osservata in 100mM KH2PO4-MeOH (1:1 vol/vol) nel range di concentrazioni da 2.4 a 24mM. Il punto medio della transizione è a 16mM.

23 Questa transizione (da a-elica a all-b)
è sotto controllo termodinamico come dimostrato dal fatto che diminuendo la temperatura di una soluzione contenente il monomero parzialmente in a-elica da 25° a -4°C si induce un cambiamento conformazionale a struttura prevalentemente b. La transizione è reversibile, per cui riscaldando la soluzione a 37°C, viene parzialmente ripristinato il profilo ad elica del monomero. Sia riscaldando che raffreddando, gli spettri CD alle diverse temperature, si intersecano in un punto isodicroico a circa 211nm: questo indica una transizione, un equilibrio tra due soli componenti, monomero con struttura parzialmente a e dimero b-sheet. Fig 5 A + B Dipendenza dalla temperatura della struttura in soluzione di Mt cpn10 (4uM) in 70% MeOH. (A) Transizione strutturale da a-elica a all-b che avviene a bassa temperatura. (B) La struttura all-b lentamente si converte nuovamente alla struttura ad a-elica quando la soluzione viene mantenuta a 37°C per 240min.

24 Regioni con struttura ad a-elica
Per identificare le regioni del monomero che possono formare la struttura a-elica, sono stati studiati peptidi sintetici troncati all’N-terminale in diverse miscele di solventi. Come per la proteina intera, i peptidi e sono parzialmente ad elica in miscele contenenti MeOH o TFE ed il loro contenuto in elica aumenta aumentando la concentrazione del solvente organico. La deconvoluzione dello spettro in 70% MeOH assegna la struttura ad elica a 11 residui per il e 10 per il Poiché nella proteina intera ci sono 25 aa in struttura ad elica, si può concludere che una o più eliche si trovano nell’N-terminale. Fig 7 A + B Spettri CD dei peptidi sintetici (10uM) corrispondenti alle sequenze (A) e (B) di Mt cpn10, mostrano la formazione di una struttura parzialmente ad elica per aggiunta di metanolo alle soluzioni di proteina in potassio fosfato, pH7.4. La concentrazione della tampone fosfato in queste miscele è stata mantenuta a 50mM.

25 Per verificare se effettivamente l’N-terminale contiene a-eliche è stato studiato il peptide corrispondente alla sequenza 1-25 di Mt cpn10 in miscele di solventi. Nella sola soluzione buffer (tampone), la molecola ha principalmente una struttura random coil ma acquisisce una struttura ad elica in MeOH-acqua (95:5, vol/vol). Dallo spettroscopia NMR di questo peptide si vede che esso contiene una a-elica tra i residui 1 e 16 e che essa è compatta tra i residui 6 e 16 ed è più ‘fragile’ all’N-terminale. Fig 8 Spettri CD dei peptidi sintetici 1-15 e 1-25 di Mt cpn10 e 1-23 di E.Coli cpn10 in presenza di micelle SDS o in 166mM KH2PO4-MeOH (0.3:0.7, vol/vol).

26 Le chaperonine 10 umana e da E. Coli
Poiché la hCpn10 è capace di attraversare le membrane biologiche (per entrare nel mitocondrio), ma la cpn10 da E.Coli (GroES) non è capace di attraversare le membrane, lo studio in diversi solventi può essere esteso a queste due cpn10 per verificare se esiste una relazione tra la struttura e il loro diverso comportamento nella secrezione. In soluzioni tampone diluite le due cpn10 (h e E.Coli) danno uno spettro analogo a quello della Mt cpn10 con un picco attorno ai 200nm (random coil) e una minore intensità nella regione della struttura secondaria. Per aggiunta di MeOH o TFE, lo spettro CD della hCpn10 cambia verso una forma di tipo elica, mentre la GroES dà uno spettro a struttura all b. Lo spettro a struttura all b della cpn10 da E.Coli è indipendente dalla concentrazione di proteina tra 0.1 e 2 uM e dalla temperatura tra -4° e 40°C. Come atteso e confermato dalla spettrometria di massa, la GroES è una miscela di monomeri e dimeri. Cosi’ in presenza di solventi organici e a temperatura ambiente, le cpn10 Mt e human sono monomeriche e parzialmente ad elica, mentre la cpn10 da E.Coli è dimerica ed ha la struttura di una proteina b. Fig 6 A + B Spettri CD della cpn10 umana (2uM) in MeOH- o TFE- 100mM KH2PO4 (1:1 vol/vol) (A) e di E.Coli cpn10 (0.1uM) in 166mM KH2PO4-MeOH (0.3:0.7, vol/vol) a 25° e 40°C (B).

27 Alcune informazioni da altre tecniche sperimentali
Per identificare le condizioni di concentrazione che favoriscono Mt cpn10 monomero, sono stati effettuati studi di equilibri di sedimentazione in tampone fosfato a pH7.4. A 9.3mM il peso molecolare medio è tra 20 e 30 kDa e ciò indica una AUTOASSOCIAZIONE in queste condizioni (monomero a dimero e trimero). La dissociazione completa avviene a 4.7mM. La dissociazione completa della proteina in soluzioni diluite viene confermata per SEC nel range di concentrazione uM. La proteina viene eluita come picco singolo a circa 23.4 min. L’incremento del tempo di ritenzione in modo progressivo con la diluizione indica la dissociazione in specie più piccole. A 4.7mM il tempo di ritenzione è 23.8 min e non varia più per ulteriore diluizione, in accordo con la completa dissociazione a monomero. Dipendenza dalla concentrazione di proteina del tempo di ritenzione di MtCpn10 misurata per HPLC/SEC in 50mM KH2PO4, pH7.4 nel range di conc uM.

28 Dai risultati visti si può pensare che la struttura in soluzione del monomero può essere descritta come un equilibrio tra conformeri parzialmente ‘foldati’ e completamente ‘random’.Gli equilibri conformazionali possono essere perturbati da cambiamenti nella composizione del solvente (es. solventi di diversa polarità) o delle condizioni della soluzione e questo può portare alla formazione ed accumulo preferenziale di uno o più conformeri. Si sono quindi studiate soluzioni diluite di Mtcpn10 in diverse condizioni di pH, T e composizione del solvente. L’effetto del pH è stato studiato nell’intervallo Al di sotto di 7.4 l’ellitticità a 200nm diminuisce e si sposta a l più elevate. Tra 5.8 e 2.9, gli spettri sono sovrapponibili e simili a quelli della Mt cpn10 oligomerica con un minimo a circa 204nm ed una ampia banda nella regione di struttura secondaria. A pH1.5 l’ellitticità ritorna a 200nm suggerendo una denaturazione acido-indotta. E’ da notare tuttavia che lo spettro CD a questo pH ha un piccolo ma significante contributo di struttura secondaria tendente alla regione dell’elica (>220nm). La forma degli spettri nell’intervallo suggerisce che il monomero si auto-associa in queste condizioni. Ciò e’ confermato da esperimenti di sedimentazione i cui risultati indicano la presenza in queste condizioni di specie oligomeriche. Quindi il monomero si autoassocia nel range di pH ed ha una composizione nella struttura secondaria (b-sheet e random coil) simile a quella osservata per la Mt cpn10 oligomerica a pH neutro. Spettri CD nel lontano UV di una soluzione diluita di Mt cpn10 (2.3uM) in 2.5 mM PO43- che mostrano la dipendenza dal pH della struttura della proteina nel range pH

29 Dipendenza dalla temperatura degli spettri
CD di Mt cpn10 monomerica (2.3uM) in 2.5mM PO43-, pH7.4 A. Intervallo -7° - 24 °C B. Intervallo +27°C - +56°C. Sono stati effettuati altri esperimenti per vedere l’influenza della temperatura sulla struttura secondaria del monomero tra -7°e 56°C. Tutti i cambiamenti spettrali sono reversibili. Lo spettro del monomero non cambia quando la temperatura varia tra -7 e 24°C e presenta la stessa ellitticità negativa a 200nm ed una spalla a 218nm. Tuttavia, scendendo al di sotto di 14°C, si ha un progressivo incremento nell’ellitticità a 200nm (random coil) ed in parallelo decresce la struttura secondaria a 218nm. Questi cambiamenti strutturali sono associati ad un punto isodicroico a 208nm, che indica un equilibrio tra due componenti. Una componente è la conformazione presente tra 14 e 24°C e l’altra è il monomero denaturato per raffreddamento la cui formazione completa non e’possibile osservare per il congelamento della soluzione refrigerante sotto i -7°C. A temperature sopra i 24°C si incrementa la struttura random coil a 199nm. Per ulteriore riscaldamento, la spalla a 218nm si sposta a 222nm. Al di sopra dei 56°C, non si hanno ulteriori variazioni.

30 La temperatura di ‘fusione’ Tm di questa transizione e’ 35.5°C(fig.A).
Dipendenza dalla temperatura dell’elliticità molare 199/200nm e 222nm del monomero (A) dell’eptamero (B) di Mt cpn10. La temperatura di ‘fusione’ Tm di questa transizione e’ 35.5°C(fig.A). E’ noto che gli eptameri di cpn10 dissociano a monomeri ad alta temperatura: per ulteriore verifica, sono stati registrati spettri CD di eptamero cpn10 a diversa temperatura (fig.B). L’ellitticità a 222 nm aumenta con la temperatura fino a 65°C. Al di sopra di questa temperatura lo spettro non cambia. La Tm di questa transizione è circa 48°C e più elevata dei 35.5°C visti per il monomero e ciò è in accordo con la necessità di ulteriore energia per dissociare l’eptamero nelle sue subunità monomeriche.

31 Spettri CD nel lontano UV di Mt cpn10 in 100mM fosfato- MeOH (1:1, vol/vol) a concentrazione 4.7uM e 19uM. L’incremento nella concentrazione porta la proteina a cambiare conformazione da parzialmene elica a all b e ciò é dovuto alle sue dimensioni A Dipendenza dalla lunghezza della proteina dell’ellitticità molare a 222nm misurata sui peptidi sintetici della proteina troncati all’N-terminale. B

32 Struttura del peptide 1-25 (elica anfifilica) e modello dell’elica predetta per il peptide 84-99
Y85 A B L86 A90 V93 V97 D92 K99 S89 E83 R93 E84 C Sequence homology Mt cpn10 84 EYLILSARDVLAVVSK 99 || • • •|• Leptin 11 KTLIKTIVTRINDISH 26 -helix A • • ||•| ••• Leptin 77 ANDLENLRDLLHLLAF 92 -helix C Secondary structure predictions 75 GTEIKYNGEEYLILSARDVLAVVSK 99 1) AAAAAAAAAAAAAA-- 2) --BB----AAAAAAAAAAAAAAAAA 3) AAAAAAAAAAAA----- A,-helix B,-sheet

33 Studio Mt Cpn10 a bassa conc. Analisi dei risultati (1)
Dato sperimentale di tipo biologico La proteina Mt Cpn10 non è presente solo nel citoplasma del micro-organismo, ma è concentrata anche sulla superficie interna della cellula batterica, per cui essa è capace di attraversare la parete cellulare della cellula. Esperimento La struttura in soluzione di Mt Cpn10 è stata studiata in condizioni di ridotta polarità del solvente o in presenza di detergenti (dati non riportati) per capire quali sono i cambiamenti strutturali che permettono alla proteina di interagire con i fosfolipidi della membrana o di attraversare l’interno altamente idrofobico della membrana cellulare. Risultati ottenuti Mt Cpn10 è monomerica a basse conc. in miscele di solventi organici in cui forma strutture stabili parzialmente ad elica (circa 25 residui). Una elica anfifilica si trova nella regione 1-16 (studi sui peptidi e NMR) e una altra è predetta sulla base di considerazioni sulla sequenza nella regione Per cui il monomero contiene in queste condizioni, due eliche, una al C e l’altra all’N terminale. Ciò è in contrasto con la struttura cristallina dell’eptamero (b). Dagli studi effettuati si evidenzia una transizione da b-strand ad a-elica, l’elica si stabilizza aumentando l’idrofobicità o l’acidità dell’ambiente. Il monomero con struttura parzialmente ad elica è in equilibrio con un dimero della proteina che ha struttura b. L’associazione a dimero è un processo reversibile favorito dall’aumento di conc. della proteina e dall’abbassamento di temperatura. (E Coli rimane b).

34 Studio Mt Cpn10 a bassa conc. Analisi dei risultati (2)
__________________________________________________________________ Osservazione sperimentale A pH neutro e al di sotto di 4.7mM, in assenza di cationi divalenti, la proteina si dissocia a monomero. Interpretazione Ciò può essere spiegato considerando l’elevato numero di cariche negative presenti nell’ ‘orifice dome’ dell’eptamero (nell’E.Coli ce ne sono molte meno, circa la metà), fatto confermato dalla capacità del monomero di autoassociarsi a dimero a pH acidi, dove i gruppi carbossilici vengono neutralizzati. Il monomero con il C-terminale con struttura b è stabile in un range di temperatura molto stretto, 14-24°C, al di sotto di 14°C si ha denaturazione. Ciò è dovuto alle interazioni tra l’acqua ed i gruppi non polari che diventano esposti nella proteina non foldata. Tali gruppi sono molto più abbondanti nelle cpn che in altre proteine globulari.

35 Studio Mt Cpn10 a bassa conc. Analisi dei risultati (3)
Ulteriori dati sperimentali dagli studi di temperatura Al di sopra di 24°C il monomero ha un secondo stadio di unfolding che non porta alla completa denaturazione. La Tm di questa transizione e della dissociazione termica dell’eptamero sono molto più basse che per hCpn10 e E.Coli Cpn10 e ciò indica una minore stabilità dell’oligomero. Ad alte temperature o in condizioni fortemente acide, Mt Cpn10 monomero non è completamente denaturato e contiene residui in struttura ad elica. Altri dati biologici che possono essere spiegati da questi risultati La struttura parzialmente ad elica può essere importante non solo nel trasporto della proteina all’esterno del batterio, ma può essere anche coinvolta in altre attività biologiche come il riassorbimento osseo, poiché esse avvengono a 37°C dove la transizione da beta ad alfa è già avvenuta.

36 Negatively charged detergents
Equilibri che coinvolgono le diverse strutture di Mt Cpn10 identificate. Small oligomers (average MW, 18 kDa) Hep + Tet + Tri + Dim Heptamer C  0.1 M [Mg2+]  2 mM C > 4.7 M [Mg2+] < 2mM C < 0.9 M 6.5  pH  1.9 N C T < 14° C Dilute Aqueous Solution _ _ _ _ Negatively charged detergents N Organic solvents C < 10 M Partially helical monomer All- dimer Organic solvents C > 10 M